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waters_e2695_training Waters Training
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--中心实验室 唐翠娥 Waters High Performance Liquid Chromatography(HPLC) Training 5 2 3 4 1 目 录 HPLC 基础知识简介 HPLC 系统组成部件 软件操作 Waters e2695实验操作 常见色仪器和色谱图故障 正相色谱法反相色谱法 固定相极性高~低中~低 流动相极性低~中中~高 组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出 适用范围溶于有机溶剂 的极性至中等 极性的分子型 化合物 较广,非极性 至中等极性的 组分 表1.正相色谱法与反相色谱法比较表 HPLC 基础知识简介 3 HPLC 基础知识简介 Chromatogram 3 HPLC 基础知识简介 Peak Peak Base Peak Height Peak Width Peak Width at Half Height Peak Area Tailing Peak: 后沿较前沿平缓的不对称峰 Leading Peak:前沿较后沿平缓的不对称峰 Ghost Peak: 假峰 Baseline Baseline Drift: Baseline Noise: Band Broadening:组分在色谱柱 内移动过程中谱带宽度增加的现象。 色谱图名词术语 3 HPLC 基础知识简介 3 HPLC 基础知识简介 理论塔板数(N): 分离效率的量度, 3 HPLC 基础知识简介 3 容量因子k' 3 分离因子α 3 HPLC 基础知识简介 理论塔板数(N): 分离效率的量度, 填料颗粒度越小,N 越大;流动相流速V 越高,N 越大。柱长越厂,N越大 。 3 k‘, α和N,如何控制? HPLC 系统组成部件 Waters HPLC 系统组成 硬件系统: –泵(515,1515,1525,600,616,626…) –进样器(7725i,717Plus…) –色谱柱(Symmetry C18, NovaPakC18,…) –检测器(2698/2996, 2487,2475,EMD…) –2695/2795分离单元(溶剂管理与样品管理集成为一体 ) 软件系统: –积分仪(746)、工作站(PC800) –数据管理系统 ￿￿ Breeze、Millennium32、Empower –Masslynx4.0软件平台(LC-MS) Waters HPLC 系统 1525-717-2487-Breeze系统 1525-717-2998-Empower系统 Waters 1525泵系统 Waters 717自动进样器 48 or 96位样品样品盘 可单独操作也可外部控制(IEEE) Waters 2998 PDA检测器 PDA检测器的三维(3D)图 Waters HPLC 系统 Alliance 系统: -2690/5分离单元 -2998检测器 -Empower2 控制软件 Waters的HPLC系统 Waters e2695系统 --1.梯度比例阀(GPV);2.进口阀;3.主柱塞(传送溶液);4.主压力传感器 ;5.蓄积柱塞(向系统输送液体);6.系统压力传感器;7.独立的线性柱塞驱 动马达(与传统一个马达驱动串联或并联泵相比,无压力波动,没有出口阀 ,减少故障率) 流速精度达到0.075% Waters e2695 进样系统系统 五个独立的24位样品盘 Waters 2998 PDA检测器 PDA检测器的三维(3D)图 Waters液相操作 1、溶剂准备:色谱纯级别 a): 过滤—0.45μm滤膜(纤维素膜水溶液, 尼龙、PTFE通用型) b):脱气—超声3-5min,排除O2,N2等。保证流量准确,提高色谱图重现 性,增加信噪比(低紫外去氧气吸收),保护色谱柱(填料氧化)。 c):溶剂截止波长:最好避免,如乙腈和水190nm, 甲醇和乙醇 210nm,等。 d):缓冲盐流动相:需现配现用,低温密封保存最多3天; 有机溶剂和缓冲盐(水)混配流动相,需低温保存。 e):溶剂混溶性:建议用色谱纯10%异丙醇or水作为过渡溶剂。 Waters液相操作 1、溶剂准备: 1525系统:A,B两通道流动相,针头清洗液(绿色)。 e2695系统: 流动相--最多可以做A,B,C,D四通道梯度混合洗脱。 灌注柱塞密封清洗液(seal wash)--一般建议使用10%~20%甲醇 水溶液。 针头清洗液(绿色)-- 一般选择样品最后几分钟洗脱相似的溶剂 作为洗脱溶剂。 Waters液相操作 2、开机一般流程:开启HPLC系统各个设备的电源。 1525系统: 开泵、柱温箱、自动进样器:待设备通过自检后,打开计 算机。 打开检测器电源:检测器通过自检后(3-5min),才能被软 件控制, 建议有流动相流经检测器后再开启电源。 启动色谱管理软件,1525系统没有控制版面,所有操作都 需在软件上执行。 Waters液相操作 e2695系统:1)打开电源开关,仪器启动诊断程序会开 始 屏幕上会显示Main界面,继续进行针 头、注射器和阀门,样品转盘托架和 溶剂管理系统这些机械部件进行诊断 测试,测试成功后,系统进入“Idle”状 态。 常见问题:“plunger homing over pressure ”,初始化中断 。 解决办法:打开排液阀,重新 初始化。 Waters液相操作 2)打开在线脱气机:在面板中直接操作或者软件 中打开。 Waters液相操作 3)色谱泵排气: 3.1)dry prime: 干抽,仪器停放很长 时间后管路空了,无法wet prime时, 用于快速排空气泡。 Waters液相操作 3.2) Wet prime: 湿抽, 快速替换管路中溶剂用的。注意 :溶剂的互溶性,如:在由缓冲溶剂改为高有机物含量的溶 剂时,为避免“分离单元”内出现盐沉淀,请使用中间溶剂( 如水)。在 Main (主)屏幕中,按 Menu/Status 显示 Status (状态)屏幕。按 Direct Functions 菜单。 排气后系统输液温度,压力波动小,一般在几十Psi以内),否则,需重做排气操作 Waters液相操作 4)清洗进样器系统: 当更换流动相或者发现注射器内有气泡 时(纯甲醇清洗),需要对进样系统进 行清洗,主要包括对定量环和注射器的 清洗 。 Waters液相操作 2、系统平衡:跑基线 正确安装色谱柱后,用准备好的流动相平衡系统,大约0.5~1h. 3、样品准备:过滤,样品瓶中应有超过1//3高度 的样品量。 4、编制仪器方法,开始试验,软件操作。 5、清洗:实验结束后,应对液相系统(进样器、泵、检测器等)、 色谱柱进行清洗。建议批量进样后,最后进一针50ul流动相,如果流动 相中有盐,则用纯水代替缓冲盐那部分比例。清洗后色谱柱和系统中需 填充需要的溶剂。 6、关机:退出Empower控制软件,依次关闭泵,检测器,电脑等电 源。 Waters软件操作 1、登入 2、项目建立 3、方法编辑。Empower中所有功能都需要相应的“方法”去实现 。 仪器方法:设置仪器参数采集样品 处理方法:对色谱数据进行处理计算 报告方法:对色谱结果打印报告 输出方法:输出色谱数据。 方法组:将上述方法组合,从而可以进行数据的批处理。 4、单次进样和样品组进样 5、3D数据处理 6、打印报告 Waters软件操作 常见仪器故障-Troubleshooting 1、流动相及溶剂瓶 流动相脱气不充分易引起噪声大,出现毛刺峰。溶剂过滤 器堵塞会引起流动相供给不畅,压力不稳。流动相被污染了 会引起基线上升,梯度洗脱出现鬼峰。 2、初始化错误:Plunger homing over pressure-在线 过滤器堵塞。 3、泵常见故障:Lost Prime-单向阀堵死。 4、进样器故障:需使用匹配的进样瓶,易出现进样针堵 塞,空白溶剂出现色谱峰时,需加倍清洗或者调整样品浓度 顺序(L-H)。 常见仪器故障-Troubleshooting 5、色谱柱故障: 6、检测器故障:灯故障易引起噪声大,灵敏度下 降。流动相和样品脏易引起流通池污染和堵塞故障 。 常见仪器故障-Troubleshooting 7、堵-压力高 柱压升高,升高的依据应该跟之前相同条件下所得的柱压进 行对比。 堵应该先排除是系统堵还是柱子堵,首先断开色谱柱,连接 两通,如果压力超过1500psi,那么系统肯定是堵了,滞后 逐一排查,清洗或者更换被堵部件。 Notes:溶剂吸滤头,进出口阀及管路(包括进样器和检测池)若被污染,应作 清洗和钝化处理。一般采用30%磷酸水溶液作为清洗剂,用6M硝酸作 为钝化剂,先清洗再钝化。清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污 垢。钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均匀的氧化膜。 (清洗钝化步骤:设ABCD25% 1ml/min 水-30%磷酸or6M硝酸 45min-水至中性-甲醇) 常见仪器故障-Troubleshooting 色谱柱堵塞引起压力高,可能由于填料表面物质吸 附或沉淀引起,则需对色谱柱进行清洗,建议方法低 流速清洗。 反相色谱柱:水,甲醇,四氢呋喃,二氯甲烷, 甲醇 和水 正相色谱柱:二氯甲烷,四氢呋喃THF, 水,甲醇, 二氯甲烷。 如果还是不行,则可考虑反冲或者购买新柱。 常见色谱图故障-Troubleshooting 1、色谱图保留时间变化问题 A)前后两针进样差异大:泵以及混合器问题。 B)同一实验条件,同一批实验保留时间一致,隔一短时间进样结果 与之前相差较大:流动相组成问题。 配比误差:1%的误差,引起RT5~15%变化。一般按重量比配比比按 体积比会更加准确一点 pH误差:0.1单位的改变,引起RT10%变化。 脱气方法:需最大程度减少流动相挥发。 温度的影响:色谱峰的保留时间变化方向一致,据经验,温度每变化 1度,保留时间会有1%~2%的变化。 常见色谱图-Troubleshooting 2、峰面积波动 同一时间多次进样波动:注射器内有气泡、流速不规律 变化(泵和单向阀问题)、前伸峰和拖尾峰的积分方法问 题、样品未完全洗脱(样品之间加一针空白样)等。 一般来说,峰面积的标准偏差在1%范围内可以接受, 0.2~0.5%是非常好的。
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