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生化技术(3)电泳技术

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生化技术电泳
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第 三 章 电 泳 技 术 电泳(electrophoresis简称EP)是指带电颗粒在电场作 用下,向着与其电荷相反的电极移动的想象。 一、基本原理 ㈠不同的带电质粒在相同电泳条件下,质粒移动速度 与质粒所带净电量呈正比而与质粒的大小呈反比,即质 粒带电荷越多在电场中移动速度越快,质粒的体积或分 子量越大移动速度越慢。当电泳到一定时间后停止电泳 ,不同的质粒会集中到相应的位置形成一条条的分离区 带,将不同物质分离开来。 如氨基酸、蛋白质、酶、核酸、激素等两性物质溶液 ,由于不同它们的等电点和分子量是不同的,电泳后形 成不同的区带,利用此性质把混合物分离开来。 ㈡不同的物质由于其带电性质,颗粒形状和大小不同, 因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同, 因此可使它们分离开。 如蛋白质分子,在PH=PI时,正负电荷相等,净电荷为 零,蛋白质在电场中不移动;若PH<PI时,蛋白质带正 电荷,向负极移动;若PH>PI时,蛋白质带负电荷则向 正极移动。 ㈢带电质粒在电场中的移动速度取决于带电的多少和分 子的大小。 二、影响泳动速度的主要因素 : 在一定的条件下,任何带电颗粒都具有自己的特定泳 动速度,影响泳动速度的因素有颗粒的性质、电场强度 和溶液的性质等。 1、颗粒的性质:即颗粒的直径、形状以及所带的净电 荷量。 2、电场强度 电场强度对泳动速度起到十分重要的作用,电场强度 越高,带电颗粒的移动速度越快。反之,则越慢。根据 电场强度的大小将电泳分为常压电泳和高压电泳。 常压电泳:多用于蛋白质等大分子物质的电泳分离 。 高压电泳:多用于氨基酸、小肽、核苷酸等小分子 物质的电泳分离。 3、溶液性质 (1)溶液的PH值 溶液的PH值决定带电颗粒的解离度,也即决定其带净 电荷的数量。对蛋白质等两性电解质而言,溶液的PH值 离其等电点越远,则其所带的净电荷量越多,在电场中 移动速度越快。因此分离某混合两性电解质物质时,应 选择一个合适的PH,使各物质所带的净电荷量差异大些 以利于分离。 (2)溶液的离子强度 溶液的离子强度越高,质粒的泳动速度越慢,但电泳的 区带却较清晰,反之则越快,分离度亦较差。 离子强度表示所有类型的离子所产生的静电力,也就 是全部的离子效应,即取决于离子电荷的总数。 原因是 : 1)若离子强度过高,带电颗粒能把溶液中与其电 荷相反的离子吸引在周围形成离子扩散,这种静电 引力导致颗粒泳动度降低。 2)若离子强度过低,溶液的缓冲能力差,不能 维持溶液的PH值,改变颗粒泳动速度 因此,电泳时溶液的离子强度一般为0.02~0.2之间,电泳 较为合适。 (3)溶液的粘度 溶液的粘度与泳动度成反比关系,粘度过大或过小, 必然影响泳动度 4、电渗 溶液在电场的作用下,对于固体支持物的相对移动称 为电渗。 1)若支持物带有一些离子基团如羧基、磺酸基、羟 基等吸附溶液中的正离子,使靠支持物的溶液相对带 正电,在电场作用下,此溶液层向负极移动。 2)若支持物的离子基团吸附溶液中的负离子,使靠支 持物的溶液相对带负电,在电场作用下,此溶液层向正 极移动。 - - - - - - - - - + + + + + + 负 极 A支持物 溶液的离子 + + + + + + + - - - - - - - - - - 正 极 B支持物 溶液的离子 当颗粒的泳动方向与电渗方向一致时,则加快颗粒的 泳动速度;当颗粒的泳动方向与电渗方向相反时,则降 低颗粒的泳动速度。 三、电泳的种类(一)按有无固体支持物分 1、显微电泳 2、自由界面电泳 是用显微镜直接观察细胞等大颗粒物质电泳行为的过 程。主要用于研究膜结构以及癌细胞和正常细胞的差异 性等方面。 自由界面电泳是胶体溶液的溶质颗粒经过电泳后,在 胶体溶液和溶剂之间形成界面的电泳过程。 在U型管中加入一定量的带色胶体溶液,分别在U型管 两端加入等量的缓冲液,两端通直流电,一段时间后会看 见一边胶体溶液的界面上升而另一边界面下降。 下行界面 上行界面 缓冲液 缓冲液 胶体溶液 3、区带电泳 区带电泳是样品物质在支持物上进行电泳的过程,各 个组分因泳动速度的不同而形成不同的带状区间,故称 区带电泳。如纸电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝 胶电泳、醋酸纤维薄膜电泳、淀粉凝胶电泳等。 (二)按凝胶浓度不同分 分为不连续缓冲系统电泳(如圆盘状凝胶电泳、SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳)、凝胶浓度梯度电泳、连续电泳 (如等电聚焦电泳) (三)按电泳槽的种类分 有水平平板电泳、垂直平板电泳、圆盘电泳 (四)按电泳原理和方式分 单向电泳、双向电泳、等电聚焦电泳、 SDS-聚丙烯酰 胺凝胶电泳、免疫电泳。 圆盘电泳垂直平板电泳 标 准 样 品 四、电泳常用的支持介质 电泳常用的支持介质可分为两大类 : 1、大孔材料:主要起支持作用,并可阻止对流,减少扩 散。如滤纸、醋酸纤维素薄膜、硝酸纤维素薄膜等,蛋 白质等物质在这些材料上电泳分离时主要取决于物质的 带电量,带电量少的移动慢,带电量多的移动快。 2、凝胶材料:除起支持作用和阻止对流,减少扩散外, 还兼有分子筛作用。如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、 淀粉凝胶等,蛋白质等物质电泳分离时既与物质的带电 性质和带电量有关,还与分离物质的分子量大小和形状 有关。 凝胶类支持物介质分离效果的好坏取决于凝胶孔径的大 小与在电场中泳动颗粒大小接近程度,即越接近分离效果 越好。 第二节 纸 电 泳 纸电泳(paper electrophoresis)是用滤纸作为支持物的一 种电泳方法。最早用于氨基酸和多肽等物质的分离,现已 应用于蛋白质及其衍生物、核酸及其衍生物、酶、激素、 糖和维生素等物质的分离研究。在临床诊断和病毒分析等 方面也起到重要的作用。 一、原理 不同带电颗粒在同一电场中泳动速度不同,泳动速度与 颗粒本身所带的净电荷量,颗粒的大小和形状有关。一般 所带净电荷量越多,颗粒越小,越接近球形,在电场中泳 动速度越快,反之则越慢。这样不同的物质在同一电场中 就得以分离。 二、材料准备 1、电泳槽 最常用的是水平式电泳槽 缓冲液槽 正负电极 电泳介质支架 电泳槽罩 + - 缓冲液 缓冲液 电泳槽罩 滤纸 电泳介质支架 纸电泳的装置图 2、缓冲液的选择 根据样品性质选用适宜的缓冲液及PH,对提高泳动度 和分离效果是有益的。如测定蛋白质样品中氨基酸组分时 ,选用PH2左右的缓冲液效果较好;而分离碱性氨基酸和 单核苷酸混合物时则用PH6.3和PH3~3.5的缓冲液为好。 3、滤纸的选择与剪裁 滤纸厚度不均匀,则电场强度不均匀,会影响电泳速 度;滤纸的吸附力大对蛋白质等带电颗粒将部分吸附而 使电泳速度快的组分的相对含量降低,并产生拖尾现象 。因此要选择优质的滤纸作为电泳支持物。 4、点样 1)点样位置:对于初次试验的未知样品,点样时应将 其点在滤纸的中央观察区带向两极电泳的情况,从而确定 正确的点样位置。 × × × 点样点 (+ ) (- ) 滤纸剪裁的规格要视实验要求和仪器设备而定。剪裁时 要防止纸边残缺或起毛。 2)点样形状:样品点样时可点成长条形或圆点形,长 条形的分离效果较好。若样品较少时可点成圆点,区带 比较集中,显色方便。进行双向电泳和另一向层析时, 样品须点成圆点或椭圆点。 第一次电泳 第二次电泳或层析 点样圆点 样品1 样品2 样品3 样品4 3)点样量:点样量随滤纸的厚度、原点宽度、样品的溶 解度和浓度、显色方法的灵敏度,以及溶质的泳动度的 变化而决定的。样品量过多,则拖尾和扩散比较严重, 分离效果差;样品量过少则无法检出。如血清的点样量 一般为5μl,氨基酸为5~20微克(茚三酮显色法),或 30~100微克(吲哚醌显色法),核苷酸为10~100微克。 对于未知样品的最适点样量则通过试验而定。 4)点样方法: 湿法点样:先将滤纸均匀的喷上缓冲液或把滤纸浸泡 在缓冲液中,后用两层普通滤纸吸去多余的缓冲液。 后架起滤纸用点样器把样品点成条状或圆点。 干法点样:利用点样器直接在滤纸上点样,点完一次 样后应将样品晾干或用电吹风吹干(对热不稳定样品 不宜),再点第二次样直到适度为止。 当样品液很稀时,应事先进行浓缩。 5、电泳 将点好样的滤纸放入电泳槽中,并把滤纸拉平,防止 中间下垂。再向两槽中加入电极缓冲液,同时将滤纸浸 湿,盖上盖子,进行电泳。 6、烘干 7、显色 8、定性定量测定 × × × × 1)定性测定:利用已知标准样品和未知样品显色比较 2)定量测定 剪洗法:将电泳分离的样品区带分别剪 下置不同的试管中,用适当的洗脱液洗 脱,再进行比色测定。 光密度法:将染色的干滤纸条通过光密度 计直接测出滤纸条上消光度的变化。 定量测定必须要有标准样作为对照。 三、纸电泳的应用 纸电泳是临床生化检验的重要手段,电泳结果可作为多 种疾病检测的生化指标。如肝炎、肝癌、肾病、血吸虫病 等临床诊断提供重要依据。 一些生化制备都可用,但其分辨率低,对要求不高, 只区分大类的样品可选用此法分离。 第三节 薄 层 电 泳 薄层电泳(thin-layer electrophoresis)是使用各种不同 的支持物与缓冲液制成适当厚度的薄层而进行电泳技术 。如硅胶、硅藻土、葡聚糖、氧化铝、淀粉等。 一、硅胶、氧化铝等薄层电泳 用硅胶、氧化铝等作为支持物涂布在玻璃板上制成薄层 板,可进行水平式电泳槽中进行水平电泳。 缓冲液在这些支持物上进行电泳时容易发生蒸发,故电 泳时应该有冷却设备。同时所加电压不宜太高,电泳时间 也不宜太长。 同时利用这些支持物作薄层进行电泳,因有吸附和电渗 现象而影响分离。吸附和电渗作用不易控制,故在每次实 验时应用对照样品进行平行试验, 二、淀粉薄层电泳(较为常用 ) 淀粉易成型,且对蛋白质吸附少,样品易洗脱,电渗 作用低,分离效果好;故淀粉薄层电泳广泛应用于蛋白 质、多肽、酶和核酸的分离分析。 1、缓冲液的选择 2、支持物的处理 3、薄层板的制作 4、加样 5、电泳 6、电泳图谱的观察 标 准 样 样 品 1 样 品 2 样 品 3 第四节 醋 酸 纤 维 素 薄 膜 电 泳 醋酸纤维素薄膜电泳(cellulose acetate membrane electrophoresis)是以醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳。 醋酸纤维素是将纤维素的羟基乙酰化二形成的纤维素 醋酸酯,由它制成的薄膜,电泳操作与纸电泳和薄层电泳 相同。 优点:分辨能力较好,即使通电时间较短(一般为 20min~1hour)区带界限也很清楚,而对蛋白质吸附较少 ,故拖尾现象较轻。对染料不吸附,对被染色区带周 围的染料能完全洗脱,不干扰测定。 缺点:具有电渗作用,但电渗作用较为均匀,对于蛋 白质的分离影响很少。 应用 : 广泛应用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白、 胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、氨基 酸及其他生物大分子的分离分析,为心血管疾病、肝硬 化、以及某些癌症等的疾病诊断提供重要依据。是临床 检验不可缺少的手段。 + - 样品 + - 血清清蛋白 α1球蛋白 α2球蛋白 β球蛋白γ球蛋白 第五节 凝 胶 电 泳 凝胶电泳是由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺凝 胶等作为支持物的电泳技术;其特点是把它们制成均匀的 凝胶,带电质粒在凝胶的孔径中进行泳动。 一、琼脂或琼脂糖凝胶电泳 (一)琼脂由琼脂糖(agarose)和琼脂果胶(agaropectin) 两种不同的多糖组成。 凝胶电泳是以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支持 物的电泳技术。 凝胶电泳与其他电泳的主要区别在于凝胶电泳同时具 有电泳和分子筛的双重作用,具有很高的分辨率。 常用琼脂凝胶的最适浓度为1%~1.5%,配制于电泳 缓冲液中,趁热(45~50℃)铺于干净的玻璃板上,制 作时应避免气泡的产生,必要时要进行抽气处理,凝胶 冷却后即可使用。 1、琼脂凝胶板上点样方法 : 挖孔法:在琼脂板加样处挖一个小孔,孔底加一薄层琼 脂溶液以封住玻璃板与琼脂交界处的孔隙,然后将样品 直接滴入或将样品混于融化的琼脂中再加入小孔。 玻璃板 琼脂凝胶 加样小孔电泳方向 滤纸插片法:在琼脂板的加样处用小刀切下一裂缝, 插入蘸有样品的厚滤纸条,纸条和琼脂板相平或稍为高 于琼脂板 玻璃板 琼脂凝胶 加样处 电泳方向 2、电泳后处理 为加强电泳区带的不溶性以及加强与染料的结合力, 可将电泳后的琼脂板浸入70%乙醇配制的2%醋酸溶液浸 泡15~20min,进行固定;烘干就成为琼脂薄膜,附着在 玻璃板上可进行显色,测定与纸电泳一样。 3、优点:琼脂凝胶电泳是一种较好的电泳技术,透明度 好,能透过200~700nm波长的光线,同时几乎不吸附蛋白 质,故电泳斑点几乎没有拖尾现象。 4、缺点:琼脂凝胶的机械性能较差,易破碎,同时低浓 度的琼脂电泳相当于自由界面电泳。因为浓度太低则琼脂 凝胶的孔径很大,就没有分子筛作用。 (二)琼脂糖凝胶电泳是将琼脂中的杂质和琼脂果胶去除 所得。由半乳糖及其衍生物构成的中性物质。 因为琼脂是多聚半乳糖的硫酸酯,含有硫酸根和羧酸基 ,这些基团可带电,产生较强的电渗现象,同时,硫酸根 能与脂蛋白的阴离子结合,使蛋白质移动缓慢故目前应用 琼脂糖来代替琼脂作电泳支持物,效果较好。 琼脂糖凝胶配制的常用浓度为0.5~0.8%。 优点:电渗作用比琼脂凝胶小,对蛋白质的吸附极微,分 辨率和重现性均较好电泳图谱清晰,透明度比琼脂好,可 直接或干燥成薄膜进行染色。 缺点:区带易扩散,电泳后必须立即固定染色。 琼脂糖凝胶电泳特别适用于免疫电泳,因抗原与抗体 易在琼脂糖凝胶的大孔径中扩散而形成沉淀线,便于观 察测定。 抗原 抗体 扩散 扩散 沉 定 线 琼脂糖板 利用琼脂或琼脂糖分离和蛋白质和核酸同样具有电荷效 应和分子筛效应。当它们的浓度较低时,凝胶的孔径较 大,适合于分离大分子的核酸如3%琼脂糖浓度适用于 70bp的核酸,1%琼脂糖浓度适用于800000bp的核酸或蛋 白质等。 - + (三)琼脂糖凝胶板的制备 封胶 加“梳子” 制备 移走“梳子” 移胶至电泳槽并加样电泳 二、淀粉凝胶电泳 1、 淀粉凝胶电泳是用经过部分水解的淀粉制成凝胶板作 为电泳支持介质;将热的10~20%的可溶性淀粉胶体溶液 注入玻板上的槽内,冷却后即凝固成淀粉胶。 2、加样方法与琼脂或琼脂糖凝胶相同 3、优点:对蛋白质吸附少,区带清晰;样品易洗脱,电 渗作用低。其中最大的优点是凝胶中的葡萄糖残基组成 三维网状结构,具有分子筛效应。 4、缺点:透明度差,染色前应用5%甘油和5%醋酸溶液 浸泡使之透明;电泳时间长,且淀粉难以确定水解程度 ,造成淀粉凝胶成分不恒定,使凝胶质量不一致。 应用于蛋白质、多肽、酶及核酸的分离测定。 三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 (polyacrylamide gel electrophoresis PAGE) 1、聚丙烯酰胺凝胶聚合的原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)+交联剂甲 叉双丙烯酰胺(Bis) 聚合交联而成。 过硫酸铵 或核黄素 催 化 剂 过硫酸铵系统:S2O32- SO42- 使丙烯酰胺单体的双键打开 形成游离 基丙烯酰胺 水溶液中 核黄素系统:为光聚合的催化剂,使丙烯酰 胺+甲叉双丙烯酰胺聚合 凝胶 注意:⑴为避免凝胶溶液中有氧气而妨碍聚合,在聚 合反应前有必要进行溶液抽气除氧;⑵为加速聚合反 应,在聚合过程中还加入四甲基乙二胺(TEME)作 为加速剂以促进聚合作用。 聚丙烯酰胺凝胶富含酰胺基,使凝胶具有稳定的亲水 性,在水中无电离基团,不带电荷,几乎没有吸附及电 渗作用。 2、凝胶的机械性能及孔径 (1)凝胶的机械性能、弹性、透明度和粘着度取决于 凝胶的总浓度。 通常用T%表示总浓度,即每100ml凝胶溶液中含有Acr 及Bis的总克数。 Acr和Bis的比例常用交联度C%表示,即交联剂Bis占单 体Acr和Bis总量的百分数。 (2)凝胶的孔径主要受总浓度T%的控制: T%越大,平均孔径越小,凝胶的机械性强度增强。 当T%值固定时,Bis浓度在5%时孔径最小,高于或低于 5%时,孔径却相应增大。 为了在凝胶电泳实验中有较高的重现性,制备凝胶时所 用的Bis浓度、Bis和Acr的比例、催化剂的浓度,聚合反应 的溶液PH值、聚合所需时间等影响泳动率的因子必须保持 恒定。 聚丙烯酰胺凝胶的孔径可用下列公式近似地计算 P= Kd √C P 平均孔径 C 丙烯酰胺浓度 K常数1.5(直角交联 ) D分子直径,一般为5A 。 3、不连续系统的凝胶电泳 不连续系统的凝胶电泳和连续系统的主要区别是:不 连续系统有两层不同孔径的凝胶系统;而且电极槽及两层 凝胶中所用的缓冲液PH值不同,在电泳过程中形成的电 位梯度亦不均匀。而连续系统在这些方面都是单一或是均 匀的。 不连续系统凝胶电泳的支持体是由样品胶、浓缩胶和 分离胶组成。 (1)样品胶:有时可不用而直接将样品加到浓缩胶的表 面。若用,一般用PH6.7~6.8的Tris-HCl缓冲液配制,为大 孔径凝胶(T%=3%;C%=20%) (2)浓缩胶:Acr一般为2%~3%,缓冲液为Tris-HCl,PH 为6.7-6.8,为大孔径凝胶.样品在浓缩胶中被浓缩成层。 (3)分离胶:Acr一般为5~10%,缓冲液常为Tris-HCl, PH为8.9左右,为小孔径凝胶,样品在分离胶中进行电泳和 分子筛分离。(T%=7%;C%=2.5%) + PH6.7 PH8.9 PH8.3 PH8.3 - 浓缩胶 样品胶 分离胶 浓缩胶 样品在浓缩胶中由于浓 缩胶与分离胶之间的不连 续性,样品从大孔径的浓 缩胶胶进入孔径小的分离 胶时被压缩成层。 不连续凝胶电泳系统 4、不连续系统凝胶电泳的分离原理 (1)样品的浓缩效应 1)凝胶层的不连续性:凝胶柱中原料的总浓度及交联度 不同,凝胶孔径大小不一样。浓缩胶的孔径大,分离胶孔 径小。带电荷的物质如蛋白质分子在大孔径凝胶层中移动 时受到阻力小,移动速度大。当接近小孔径的分离胶时, 遇到阻力大移动速度减慢。使样品浓缩,形成窄带。 浓缩胶 分离胶 样品层被 压缩成层 2)缓冲液离子成分的不连续性 电泳液中含有甘氨酸离子PH为8.3,样品层及浓缩胶层 中含有氢离子PH6.7;分离胶层中亦含有氯离子PH8.9。 在PH8.3时,甘氨酸的解离度(α)较小,其有效迁移率 亦较小故甘氨酸常被称为慢离子。 盐酸全部解离,其有效迁移率Cl-最大,称为快离子 而蛋白质在 PH为6.7时,其有效迁移率在上面两者之间 。 PH6.7 PH8.9 PH8.3 浓缩胶 PH8.9 PH8.3 PH6.7 甘氨酸离子 蛋白质离子 Cl-离子 进行电泳时,大孔径浓缩胶层中的Cl-快速向阳极移动 ,蛋白质离子和甘氨酸离子缓慢移动。由于Cl-离子的快速 移动使Cl-后面胶层中的离子浓度骤然降低,形成一个低电 压或称高电位梯度(电势差)区域。 电泳速度取决于电位差和有效迁移率,由于Cl-、蛋白 质离子、甘氨酸离子的迁移率各不相同。 Cl-离子在前, 蛋白质居中而甘氨酸离子落后形成三种粒子界面,蛋白质 离子聚集在Cl-和甘氨酸离子之间,各蛋白质分子所带电荷 不同,因此被浓缩成很窄的薄层。 在分离胶层,缓冲液PH8.9,甘氨酸进入分离胶后,解离 度增加,使有效迁移率与Cl-接近,因此甘氨酸离子的迁移 率超过蛋白质离子。另外分离胶孔径小,蛋白质泳动阻力 增大,移动率缓慢。最终导致分离胶层不具备浓缩效应而 只具有分离效应。 3)pH值的不连续性 为控制慢离子的离解度,从而控制其有效迁移率,必 须使浓缩胶与分离胶之间的pH值有所区别。这样在样品 层和浓缩胶层中,慢离子有效迁移率比样品中各质粒的 有效迁移率低,使样品夹在快慢离子之间。而在分离胶 层中,调节pH值,使慢离子的有效迁移率比样品的有效 迁移率快,使样品离子的移动不再受快慢离子界面的影 响。只依靠于样品质粒的电荷大小及凝胶的分子筛作用 达到彼此分离的目的。 (2)分子筛效应 在凝胶电泳中因凝胶浓度不同,其网状结构孔径大小 也不一样,通过的样品质粒如蛋白质分子量范围也就不 一样。因此可根据分离对象进行调节凝胶的浓度,使分 离物质分子大小与网状孔径大小相适应。 在分离胶中孔径较小,分子量及构型不同的样品,通 过一定孔径的凝胶时所受阻力不同,从而引起泳动速度的 变化。所以多种蛋白质分子即使所带电荷相同,迁移率在 电场中相等,但在聚丙烯酰胺凝胶中受凝胶孔径大小的影 响,大分子受阻力大,走在后面;而小分子受阻程度小, 走在前面,最终达到分离目的。 分子量范围( 蛋白质) 凝胶浓度( %) 分子量范围( RNA) 凝胶浓度( %) <104 20~30 <104 15~20 1~4×104 15~20 104~105 5~10 4×104~1×105 10~15 105~2×106 2~2.6 1×104~5×105 5~10 >5×105 2~5 (3)电荷效应 由于样品中质粒所带电荷不同,有效迁移率也不同,电 荷多的质粒移动快,反之则慢。 4、聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点 兼有电泳及分子筛的功能,提高分离能力,是目前分辨 力最高的电泳。 具有相对的化学稳定性、纯度高、溶解度小、无电离基 团,受PH值和温度变化较少,几乎没有吸附及电渗现象, 并可通过改变交联度而调节孔径大小范围。 能精密地分离各种蛋白质、核酸等组分,适用于少量 样品的分离鉴定,又适用于较大试样的分离制备。还可测 定蛋白质或核酸的分子量,核酸的序列分析等。 浓缩胶 样品胶 分离胶 溴酚蓝带 12345 a b c d e a b c d e带为标准蛋白质区带 四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 聚丙烯酰胺凝胶电泳能将大分子混合物分离,主要是 由于样品中各分子的电荷和分子大小差别所致。要利用 凝胶电泳准确测定某一蛋白质或多肽的分子量,就必须 将电荷效应去掉或减少到最小,使被测物质的泳动速率 的大小完全取决于物质的分子量。 SDS(十二烷基硫酸钠)是一种阴离子表面活性剂, 能与蛋白质分子的疏水基团结合,将蛋白质分子分解成 亚基组分,同时使蛋白质分子带上大量SDS-阴离子。蛋 白质负载大量负电荷大大超过天然蛋白质的原有电荷, 蛋白质之间原有的电荷差异无显著效应。SDS-蛋白质复 合物在凝胶中电泳的迁移率不再受蛋白质原有电荷和分 子形状的影响,而是决定于蛋白质的相对分子量。 不同的泳动速率仅仅反映蛋白质分子量的差别,这样根 据标准蛋白质已知分子量的对数和电泳迁移距离所得的标 准曲线,查出被测蛋白质的分子量。 lgMw=lgK-bm a b c d e a b c d e表是已知分子 量的标准蛋白质 lgMw 相对迁移率 b-斜率 m-迁移率 Mw –蛋白质的分子量 蛋白质泳动的迁移率与蛋白质分子量的对数呈直线关系 。 浓缩胶 样品胶 分离胶 溴酚蓝带 12345 a b c d e a b c d e f带为标准蛋白质区带 缺点:SDS与蛋白质结合后,蛋白质的空间构象发生改 变,使蛋白质发生变性。 相对迁移率= 溴酚蓝移动距离 某蛋白质移动距离 f 五、 凝胶电泳的操作要点 1、凝胶的制备 (1)把单体分别制成储备液(除过硫酸铵在用前配制外 ) (2)制备凝胶所用的仪器必须干净和干燥。 (3)先制备分离胶 再注入浓缩胶 最后制样品胶 聚合后 (凝胶聚合过程,必须用蒸馏水封闭)也称灌胶。 (4)必要时进行抽气,以避免凝胶中存在气体而产生气泡 。 2、电极缓冲液的选择 3、加样 4、电泳 5、染色与固定 6、计算相对迁移率, 并作标准曲线,求出 样品分子量。 a b c d e f 12345 第一向电泳切下一个样 品的全部区带贴在等电 聚焦电泳的凝胶上。 双向电泳示图 第六节 等 电 聚 焦 电 泳 1、定义:等电聚焦(Isoelectric focusing)是一种利用具有 PH梯度的电泳介质来分离等电点(PI)不同的蛋白质等两 性电解质的电泳技术。 等电聚焦电泳分离物质的依据为各组分之间等电点的差异 ,而与物质分子量大小无关,不必考虑分子筛效应。 等电聚焦电泳较不连续性聚丙烯酰胺凝胶电泳更高,特 别适合于分离分子量相同而电荷不同的两性大分子。 2、等电聚焦电泳的优点: 3、等电聚焦电泳的缺点: 一、基本原理 1、PH梯度的形成 在电泳管中建立稳定的PH梯度是等电聚焦电泳的关键 。 将PK和PI各自相异却又相近的两性电解质溶液倾入电 泳支持介质中,在电场作用下形成PH梯度。当电流通过 时,等电点小的两性电解质(PI1)在中性溶液介质中发 生解离、带负电荷,向具有硫酸为电极溶液的正极移动 。当它泳动到阳极时,与正极溶液电离出的H+中和失去 电荷、停止泳动,这样缓冲力大的载体两性电解质使周 围溶液的PH等于其等电点PI1。同理,等电点大的两性电 解质( PI2 )也向正极移动,由于PI2 大于PI1,它定位于 第一种PH值最低的两性电解质之后,并使其周围介质的 PH值保持在它的PI2。依次类推,经过足够时间后,两性 电解质混合物中各组分按等电点递增的次序,从正极到 负极排成一个平滑的PH梯度。 PH (+ ) (- ) PHb PHa (碱液) 酸液(H2SO4或H3PO4 ) 2、等电聚焦电泳分离蛋白质的过程 + - P H 增 大 等电聚焦电泳时必须有一个稳定的PH梯 度介质,使PH值从正极到负极依次增加。 形成线性的PH梯度。 蛋白质是两性电解质,它带的电荷随溶 液酸碱度的变化而变化,即在酸性溶液中 带正电荷,在碱性溶液中带负电荷,因此 在外加电场作用下或向正极、或向负极泳 动。 - + 蛋白质在PH梯度中泳动行为 - + PH=PI (1)蛋白质分子在负极端时,分子带负电荷,在电场作用下向正极 移动,当分子的平均位移为零(即分子停止泳动)此时的PH=PI。 (2)同样,分子在正极端,分子带正电荷,在电场作用下向负极移 动,最后也在PH=PI处不再位移。 PI1 PI2 PI3 PI4 PIn (3)当将等电点分别为PI1 、PI2 、PI3 、PI4 、PI5 …Pin的蛋白质混合 物加入有PH梯度的电泳管时,在电场中经过一定时间后,混合物中各 组分将分别聚焦与各自等电点相应的PH介质区域,形成分离的各种蛋 白质区带。从而得到清晰的分离图谱。 不管蛋白质放在两性电解质支持物的那个位置,在电场作用下都会 聚焦在PH梯度PH=Pin的地方,这种行为叫聚焦作用。 3、两性电解质载体 能建立稳定PH梯度的两性电解质是一种多羟基、多胺基的脂肪族混 合物,常称为载体。其理化性质为: (1)缓冲能力强。 (2)导电性能好。 (3)分子量小。 (4)紫外吸收值低。 (5)一般与样品不起化学反应。 4、支持PH梯度的介质 在溶液中蛋白质聚焦后,由于分子的扩散对流,往往破坏样品的 聚焦作用,使已分离的蛋白质区带重新混合,所以电泳管中必须有 抗对流的支持介质,以减少扩散作用,保证聚焦过程进行 支持PH梯度介质有:(1)密度梯度溶液如蔗糖;(2)凝胶 如聚丙烯酰胺凝胶。 5、等电聚焦电泳的操作要点 练习题 1、影响带电颗粒在电场中泳动的因子有哪些? 2、为什么不连续系统或连续系统的聚丙烯酰胺凝胶电泳 比琼脂电泳分辨率高? 3、哪些因子影响聚丙烯酰胺凝胶的化学聚合速度? 4、简述凝胶电泳法测定蛋白质分子量的原理及操作步骤 。 5、凝胶电泳有哪些用途?用它怎样鉴定样品的纯度? 6、等电聚焦电泳的原理是什么?和一般凝胶电泳有何 不同? 7、配制15%的聚丙烯酰胺凝胶溶液10ml,问需丙烯酰胺 和双丙烯酰胺各为多少克?
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