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中药制剂检验技术

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中药制剂检验技术 Modern Test Technology of Chinese Medicine Preparation 课程内容 理论部分 第一章 绪论 第二章 理化鉴定 第三章 常规检查 第四章 杂质检查 第五章 含量测定 实验部分 (共10个实验) 第一章 绪论 第一节 概述 第二节 药品标准 第三节 中药制剂检验的一般程序 第一节 概述 一、基本概念 (一)中药制剂检验技术:(Analysis of Chinese Medicine Preparation) 以中医药理论为指导,运用现代分析理论 和方法研究中药制剂质量的一门应用学科。 十万分之一天平可见-紫外分光光度仪 高效液相色谱仪 CS-9301薄层扫描仪 气相色谱仪 (二)中药制剂 根据药典、制剂规范和其他规定的处方,将中药的 原料药物加工制成具有一定规格,可以直接用于防病、治 病的药品。 (三)中成药 中药制剂中的一些药品经过卫生部门审批,在市场 上允许出售,可以通过医生诊断给患者使用,也可由患者 根据经验与常识直接使用的中药制剂产品称为中成药( Chinese Patent Medicine)。 (四)药品质量 反映药品符合法定质量标准和预期效用的特性之总 和。其内涵包括:药品质量与标准的符合性,疗效的确切 性,使用的安全性,以及储存期的稳定性 二、学习目的、意义 • (一)中药制剂检验是控制药品质量的重要的技 术监督手段 • (二)保证并提高中药制剂质量,促进中药现代 化 • (三)培养三种能力:①根据药品标准,对中成 药进行全面检验的能力。②解决生产储存中的质量 问题。③根据处方和工艺,建立药品质量标准的能 力(创新能力)。 三、中药制剂检验的特点 与西药制剂检验比较,难度较大,问题较多,更具挑战性 (一)成分复杂,干扰性较大,供试品(溶液)制备困 难,多需复杂的预处理。 (二)杂质及有害物质易混入,纯度检查工作量较大。 (三)被检成分多样且含量较低,多采用现代分析技术 ,如各种色谱法和光谱法。 (四)目前尚有相当多的制剂有效成分(指标性成分) 不明确,缺乏客观的内在质量标准,需积极开展药检科 研工作,全面提高中成药检验工作水平,故更具挑战性 。 四、影响中药制剂质量的因素 1.原料药材的品种、规格、产地、药用部位、 采收季节、加工方法的影响 2.炮制方法的影响 3.生产工艺的影响 4.中药制剂的包装、储藏、保管的影响 【注】合格的药品不是检验出来的,而是生 产管理出来的,因此必须实行全面质量管理 (TQC),推行GMP。 一、药品标准: 药品标准是国家对药品质量规格及检验 方法所作的技术规定,是药品生产、供应 、使用、检验和管理部门共同遵循的法定 依据。 二、标准类型 《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》 ) 共颁布8版 国家药品标准 包括《国家中成药标准汇编 》(地方标准升国家标准)、《新药转正标 准》和《卫生部药品标准》等。 第二节 药品标准 中 国 药 典 中 国 药 典 国家药品标准 三、药品标准的性质 药品标准由国家药典委员会制定和修定,国 家食品药品监督管理局颁布。《药品管理法》规 定,药品必须符合上述两种药品标准,故药品标 准为法定的、强制性的国家技术标准。 【注】以前的各省市自治区药品标准(即所谓地 方标准)自2004年1月1日起作废(中药材和饮片 除外)。 四、《中国药典》简介 • (一)《中国药典》历 史沿革 • (二)现行的为2005 年版(第八版), 2005年7月1日实行。 本版药典首次分为三部 ,一部收载中药材和中 药制剂等,二部收载化 学药品、抗生素等,三 部收载生物制品。 (三)现行《中国药典》(一部)的特点 1.总品种为1146种,其中药材及饮片551种;植 物油脂和提取物31种;成方制剂和单味制剂564 种(修订234种,新增116种) 2.HPLC由2000 年版105个上升至518个;GC则 由11个上升至37个;TLCS由60个下降至45个。 HPLC梯度洗脱、蒸发光散射检测器、高效毛细 管电泳法等新技术首次被收载。 3.中药鉴别普遍应用TLC,中药制剂应用总数达 1165,显色反应使用率明显下降。重金属检查新 增了AAS和ICPMS。中药制剂中有438品种个建 立了含量测定,其中大量使用了仪器分析方法。 4.体现中医药整体观念,采用多组分或特征色谱 峰群综合控制药品质量。 (四)药典主要内容 1.凡例:记载有关术语、符号和计量单位等的规定 和解释,以规范人们正确理解和执行药典。具有法 定约束力。 2.正文:由被收载的各品种的药品标准所构成,是 药典的主体,具有法定约束力。中成药药品标准一 般包括:药品名称、处方、制法、性状、鉴别、检 查、含量测定、功能与主治、用法与用量、注意、 规格和贮藏等项目。其中性状、鉴别、检查和含量 测定四项为药检工作的主要内容。 3.附录:主要由制剂通则、通用检测方法、通用 试剂和指导原则等四部分组成。前三部分具有法 定约束力。指导原则为现行药典新增内容,包括 “中药质量标准分析方法验证指导原则”和“中 药注射剂安全性检查法应用指导原则”,虽不作 为法定要求,但对执行药典考察药品质量规范质 量要求和统一药品标准将起到重要的指导作用。 药检工作者应很好地研读药典,只有正确理解有 关规定,熟练掌握各种检验技术,才能做好药检 工作。 63年版药典牛黄清心丸标准 二 妙 丸 Ermiao Wan 【处方】 苍术(炒) 500g 黄柏(炒) 500g 【制法】 以上二味,粉碎成细粉,过筛,混匀,用水泛丸,干燥,即 得。 【性状】 本品为黄棕色的水丸;气微香,味苦涩。 【鉴别】 (1) 取本品,置显微镜下观察:草酸钙针晶细小,长5~32m ,不规则地充塞于薄壁细胞中。黄色纤维大多成束,周围细胞含草酸钙 方,形成晶纤维,含晶细胞壁木化,增厚,可见黄色不规则分枝状石细 胞。 (2) 取本品粉末2g,置具塞试管中,加乙醚10ml,振摇10分钟, 分取上清液2ml置具塞试管中,加高锰酸钾试液2 滴,振摇1 分 钟,红色即消失。 (3) 取本品0.1g,研碎,加甲醇5ml,置水浴上加热回流15分钟, 滤过,滤液补加甲醇使成5ml,作为供试品溶液。另取黄柏对照 药材0.1g,同法制对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品,加 甲醇制成每1ml 含0.5mg 的溶液,作为对照品溶液。照薄层色 谱法(附录Ⅵ B)试验,吸取上述三种溶液各1ul,分别点于同 一硅胶G薄层板上,以苯-醋酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试 液(12:6:3:3:1)为展开剂,置氨蒸气预饱和的展开缸内,展开, 取出,晾干,置紫外光灯(365nm) 下检视。供试品色谱中,在 与对照药材色谱相应的位置上,显相同的黄色荧光斑点;在与 对照品色谱相应的位置上,显相同的黄色荧光斑点。 【检查】 应符合丸剂项下有关的各项规定(附录Ⅰ A)。 【含量测定】 取本品适量,研细,取约1g,精密称定,置索氏提取 器中,加乙醚适量,加热回流1~2小时,弃去乙醚液,残渣挥去乙醚 ,加甲醇适量,回流提取至提取液无色,将提取液(必要时适当浓缩 )转移至50ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。 另取盐酸小檗碱对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml 含0.06mg 的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录Ⅵ B)试验,精密吸 取供试品溶液1ul、对照品溶液1ul和3ul,分别交叉点于同一硅胶G薄 层板上,以苯-醋酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液(12:6:3:3:1)为展 开剂,置用氨蒸气与展开剂同时预饱和15分钟的双槽展开缸内,展开 ,取出,晾干,照薄层色谱法(附录Ⅵ B薄层扫描法)进行荧光扫描 ,激发波长=365nm,测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分 值,计算,即得。本品按干燥品计算,每1g含黄柏以盐酸小檗碱 (C20H17NO4·HCl) 计,不得少于3.0mg。 【功能与主治】 燥湿清热。用于湿热下注,足膝红肿 热痛,下肢丹毒,白带,阴囊湿痒。 【用法与用量】 口服,一次6~9g,一日2次。 【贮藏】 密闭,防潮。 附录目次 第三节 中药制剂质量检验一 般程序 一般程序和内容: 取样预处理 分析报告 性状—鉴别—检查—含量测定 一 、取样 (Sampling) 1.定义: 从整批成品中按取样规则抽取出一部分具 有代表性的供试药品进行检验、分析、留样 观察的工作称之为取样。 样品理论上应反映大样的情况,取样的代 表性直接影响检验结果的正确性,必须重视 。 2.要求:科学性、真实性、代表性 3.原则:均匀、合理、随机 4.方法: (1) 取样前应注意生产批号、品名、厂家、规格、包装样 式是否一致,检查包装的完整性、清洁程度及有无水迹、霉 变或其它物质污染等,并详细记录。凡有异常情况应单独检 验。 (2) 团体取样,应以同一批号的批包装和最小包装的四角 及中间五处随机取样。混匀后,得总供试品,再按四分法多 次(至少三次)递减取样,直到剩余量足以满足检测所用量 为止,即得平均供试品。 (3) 液体制剂取样(合剂、酊剂、酒剂、糖浆剂等),取 单包装样品应按照固体取样方法进行取样。取得平均供试品 后,将几个单包装混匀后再取样(每个单包装应充分摇匀) ,一般大剂量包装不适用。 5.取样量: (1) 平均供试品的量一般不得少于实验所须的三倍 量,一分实验、一分复核、一分留样。 (2) 供实验用的供试品的量至少可供三次全检,即 三次平行实验用量。 (3) 总供试品的量一般为: 颗粒剂------100g 片剂------200片 液体制剂------ 200ml 其它:参照上述情况取样 贵重药,酌情少量抽取 二 、预处理(Pretreatment) 1.粉碎(固体制剂): 例 : 大蜜丸 用小刀或剪刀将其切成小块, 加硅藻土研磨分散。 水 丸 用乳钵直接进行研磨,研细即可 。 片 剂 用小刀刮去糖衣层,置乳钵中研 细即可。 栓 剂 可使用小刀将其切成小块。 散剂、颗粒剂、硬胶囊剂 一般不需粉 碎, 可直接提取。 2.提取: (1) 溶剂提取法: 浸渍法:热浸、冷浸 回流法:直接回流法、连续回流法 超声波提取法:10min=回流1小时 注:如提取液用作含量测定用则应注 意在提取完毕后补重。 (2) 水蒸气蒸馏法: 提取挥发性成分,例如:六味地黄丸 中丹皮酚的提取。 (3) 其它: 升华法、超临界流体萃取法。 连续回流 水蒸气蒸馏 超声波提取 微量升华 3.纯化: (1) 液—液萃取法: 缺点:操作烦琐,易引起损失,易乳化。 仪器:分液漏斗 (2) 柱色谱法: 常用填充剂为:氧化铝、硅胶、大孔树脂 液液萃取固液萃取 三、 分析 (一) 性状检查(Description): 性状检查系指根据药品的形状(形态)、颜色、气 味的外在特征对药品的真伪进行鉴定。 此法主要用于药品的真伪鉴别,但也可反映一定的 内在质量,且操作简便,是一项重要的检验项目。 例:2005版药典有如下描述: 安宫牛黄丸:黄橙色或红褐色大蜜丸,气芳香浓郁,味微苦。 六味地黄丸:黑褐色大蜜丸,微甜而酸。 (二) 鉴别(Identification): 鉴别是指检定药品真实性的方法,包括显微 鉴别、理化鉴别。 鉴别是反映药品内在质量的重要方法,主要 用来判断药品的真伪。 1.显微鉴别: 利用制剂中直接以药粉入药的药材的粉末特 征鉴别药材的存在与否,具特异性。在制片 时应注意适量取样以及透化适当。 例如:大黄:草酸钙簇晶大而且钝 山药:草酸钙簇晶较长 黄柏:石细胞黄色分枝状 2.理化鉴别: (1) 化学反应法: 对于不同的成分有各自的沉淀反应或显色 反应,由于化学反应适用的为一类成分所以 无特异性,在采用本方法时应作阴性、阳性 对照以防止假阳性反应。 例如:生物碱的沉淀反应。 (2) 升华法: 适用于含有升华性成分的制剂。 (3) 光谱法: ① 荧光法: 将提取液点于滤纸上,待干后于紫外365nm或 254nm下观察荧光斑点,进而对药品进行鉴定。 ② 可见—紫外分光光度法: 以标准品为对照,依据最大吸收波长来判断成分 的存在与否。 ③ 红外分光光度法: 多用于单方制剂的红外指纹图谱。 (4) 色谱法: 包括纸色谱(PC)、薄层色谱(TLC)、高 效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)等 ,其中薄层色谱2000版药典中使用最为广泛 。而高效液相色谱和气相色谱则多用于含量 测定方面。 三、检查(Check) 系指对药品基本品质和纯度的检测。包括: 1.制剂的常规检查 例如:丸剂、片剂的重差检查和水分测定。注射 剂的可见异物检查(原澄明度检查)。糖浆剂的 相对密度和pH的测定 2.杂质检查 例如:灰分、重金属、砷盐、农残、甲 醇量等的限量检查。 3.菌检(卫生学检查)例如:微生物限度和无菌检查 。 四、含量测定 (Content Determination) 指用定量分析的方法,对药品质量 的优劣进行评价。 包括:有效成分的含量测定,挥发 油的测定,浸出物的测定等。 五、出具检验报告 原则:书写要规范,结论要有据明确。 【注】①药品需多学科(物、化、生、计)、 多层面(微观、宏观;经典、现代)、多角 度(定性、定量;个性、共性;正面、负面 )全面进行检验,才能控制其质量。 ②药品应严格按照药品标准规定,逐项 全检。只有全部检验符合规定,才能给出合 格的结论,若其中一项不符合规定,则判为 不合格药品(假药或劣药)。 第二章 中药制剂的理化鉴别 (Physicochemical Identification) 第一节 必备知识 第二节 一般化学反应法 第三节 升华鉴别法 第四节 荧光鉴别法 第五节 薄层色谱鉴别法 第六节 气相色谱鉴别法 第七节 高效液相色谱鉴别法 第一节 必备知识 一、理化鉴别的意义 中药制剂的理化鉴别是利用其药味(原料药)中的 某种或某类指标性成分的理化性质,通过化学分析 方法和仪器分析方法,检测有关成分在制剂中是否 存在,进而对所含药味与处方的一致性做出判断, 达到鉴定药品真伪之目的。 药品真实性的检定是药品质量控制的重要内容 ,是评价药品质量的重要依据。如果药品缺乏真实 性,则可判定为不合格药品,并以假药论处。 二、理化鉴别的特点 理化鉴别是以制剂药味中的指标性成分(主要 为有效成分或特征性成分)为检测对象,故可以 更加客观深刻地评价药品的真实性。对于液体制 剂或其它不含原料药粉的制剂,理化鉴别则显得 为重要。 三、理化鉴别的方法 目前中国药典收载的理化鉴别方法有:一般 化学鉴别法、微量升华法、荧光鉴别法、分光光 度法、薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱 法等。 其中色谱法尤其是薄层色谱法得到广泛的应 用,这主要是由于色谱法具有分离分析双重功能 ,从而大大提高了鉴别工作的灵敏度和专属性, 并成为今后中药制剂鉴别的发展方向。 《中国药典》(2005)新增中成 药(116种)鉴别方法 鉴别鉴别 方法 应应用品种说说 明 薄层层色谱谱114 高效液相色谱谱4 气相色谱谱3主要鉴别挥发鉴别挥发 性成分 分光光度法0 一般化学反应应法2 荧荧光鉴别鉴别 法0 微量升华华法0 显显微鉴别鉴别 法29适用于含药药粉的剂剂型 第二节 一般化学反应法 ( General Chemical Reaction) 一、原理一、原理 一般化学反应法是利用检测试剂与制剂中 的指标性成分发生化学反应,根据所产生的 颜色、沉淀或气体等现象,来判断某些成分 或某些药味的有无。由此可见,所谓一般化 学反应法即通常所说的显色反应和沉淀反应 。 二.特点二.特点 1.一般化学反应法具有操作简便,适用性较 强等特点。 2.其否定功能往往强于肯定功能,专属性较差 。 3.易发生假阳性或假阴性反应 假阳性或假阴性反应克服方法如下: ①对样品进行预处理,除去干扰性成分,富集被检成 分。 ②选用专属性较强的检测试剂。 ③必要时做阳性或阴性对照试验加以验证,保证其专 属性和灵敏度。 三、常用的一般化学反应 主要用于制剂中生物碱、黄酮类、蒽醌类、 皂苷、香豆素、萜类以及各种矿物类成分的鉴别 (一)生物碱 1. 碘化铋钾反应 产生红棕色沉淀 2. 碘化汞钾反应 产生类白色沉淀 3. 硅钨酸反应 产生白色沉淀 4. 苦味酸反应 产生黄色结晶性沉淀 需在酸性条件下进行。注意事先排除其它成 分的干扰。少数生物碱不与上述通用沉淀试剂反 应,而具有专属性较强的其它反应。 (二)黄酮类化合物 最多使用的检识反应为盐酸—镁粉反应,呈紫 红色。大山楂丸(山楂)、抗骨增生丸(淫羊藿 )、参茸保胎丸(黄芩)等。此外,黄芩提取物 采用二氯氧锆-盐酸显色反应进行检识。 (三)蒽醌类化合物(三)蒽醌类化合物 主要应用碱液反应(Borntrager反应),阳性 反应呈红色,加酸红色褪去呈黄色。例如大黄流 浸膏。 (四)皂苷 常用的定性鉴别反应有: ① 泡沫反应 样品水溶液振摇后,产生持久性 泡沫。 ② 醋酐—浓硫酸反应 甾体皂苷呈现污绿色, 三萜皂苷呈现红、红紫色。 ③ 浓硫酸反应 呈现红、红紫色。 ④ 三氯化锑或五氯化锑反应 氯仿液呈紫兰色 。 ⑤ 氯仿—浓硫酸反应 氯仿层出现红色或兰色 ,并具绿色荧光。 例:地奥心血康胶囊(黄山药和穿山龙薯蓣的 提取物)、养心定悸膏(甘草、红参、麦冬)。 (五)香豆素、内酯类和酚类 常用的检识反应有: ① 氯亚氨基-2,6-二氯醌-四硼酸钠反应( Gibbs反应),呈现蓝色。 ② 异羟肟酸铁反应 呈红色。 应用品种有:养阴清肺膏(牡丹皮)、前列 舒丸(牡丹皮)等。 (六)挥发性成分 主要使用香草醛—浓硫酸反应检识此类成分, 正反应呈红、红紫色。应用品种主要有:万应锭 (冰片)、牛黄解毒片(冰片)、养心定悸膏( 桂枝、生姜)等。 (七)矿物药 朱砂、石膏、雄黄等为中成药中常见的矿药。 1.朱砂(主含HgS) 主要采用铜片反应。 HgS+2HCl+Cu→CuCl2+Hg(白 △↑)+H2S 天王补心丹等中成药中朱砂的鉴定。 2.石膏、牡蛎、海螵蛸等 此类药物均富含钙盐,主要采用草 酸铵反应 。 CaSO4+(NH4)2C2O4→CaC2O4(白)↓+(NH4)2SO4 CaC2O4溶于盐酸,难溶于醋酸。 CaC2O4+2HCl→CaCl2+H2C2O4 止咳桔红口服液(石膏)、安胃片(海螵蛸)、龙牡壮骨颗 粒(牡蛎、龙骨、乳酸钙、葡萄糖酸钙等) 3.雄黄(主含As2S2) (1)氯化钡沉淀法(检出硫) As2S2+KClO3+4HNO3 2K3AsO3+H2SO4+Cl2↑+4NO↑ H2SO4+BaCl2 BaSO4↓(白) 牙痛一粒丸 (2)硫化氢反应(检出砷) 2As2S2+7O2 2As2O3+4SO2↑ As2O3+3H2O 2H3AsO3 2H3AsO3+3H2S As2S3(黄)+6H2O As2S3在盐酸中析出黄色沉淀,并溶于碳酸铵中 4As2S3+12(NH4)2CO3 4(NH4)3AsO3+4(NH4)3AsS3+12CO2↑ 小儿惊风散等。 [o] (八)动物药 常含有较多的蛋白质或氨基酸、故鉴别此类药 物,常使用茚三酮反应,正反应呈红紫色。 例如:龟龄集(鹿茸、海马、等)、参茸保胎 丸(阿胶、鹿茸)等。 四、操作方法 (1)供试液的制备(见前述) (2)操作方式 大多为试管反应 ,或在检测试纸上、或在蒸发皿( 坩埚)中进行反应 五、结果判断 将反应现象或结果与药品标准对照,若一致则符合 规定。若不一致则判定为不符合规定。 六、注意事项 ① 试管反应一般使用2×10cm试管,取供试液1~2ml。加 入检测试液时,试管应稍倾斜,试液应沿试管内壁逐滴加 入,滴管下口不得触及内壁。 ② 加入反应试液后一般需振摇试管,使之与供试液混匀。 振摇时应缓缓摇摆振摇,不得上下振摇,手指不允许堵塞 试管口,若需层反应,则不得振摇试管。 ③ 一般需在白色背景下观察反应所产生的颜色或沉淀,若 沉淀为白色或类白色则需在黑色背景下观察。 ④ 如果反应需加热,一般在水浴中加热。用试管夹夹持试 管,内容物不得超过容积的2/3,试管应倾斜45度,试管口 不得闭塞,并不得朝向人。加热有机溶液绝对不允许使用 明火热源。 ⑤ 如果反应需无水条件,必须保持试管、蒸发皿等容器的 干燥,例如醋酐—浓硫酸反应。 七、应用实例 1.千柏鼻炎片 2.小儿清热止咳口服 液 3.茴香橘核丸 4.地奥心血康胶囊 5.养阴清肺膏 6.安胃片 7.天王补心丹 8.牙痛一粒丸 9.中风回春片 第三节 升华鉴别法 (Sublimation) 一、原理一、原理 本法是利用某些成分的升华性,在一定 温度下将其从制剂中升华分离出来,并以 升华物所具有的某些理化性质作为制剂鉴 别的依据。 二、特点二、特点 升华法具有简便、实用等特点,由于升 华性仅为少数中药化学成分所具有且升华 物纯度较高,故该法专属性亦较好。 三、操作方法三、操作方法 大多采用微量升华法,少数使用坩埚法 或蒸发皿法,在此,仅介绍微量升华 。 六味地黄丸中冰片升华物 六味地黄丸中冰片升华物显微镜下观 六味地黄丸中冰片升华物香草醛浓硫酸显色 四、注意事项四、注意事项 ① 升华时应缓缓加热,温度过高,易使药粉焦化,在载玻片上产 生焦油状物,影响对升华物的观察或检识。温度的控制可通过调整 酒精灯火焰与石棉板的间距来实现。 ② 样品粉末用量一般约0.5g,过少不易产生足够量的升华物。 ③ 可在载玻片上滴加少量水降温,促使升华物凝集析出。 ④ 无金属片,可用载玻片代替。 五、应用实例(P58) (一) 万应锭的鉴别 (二)小儿惊风散的鉴别(反应机理) (三)明目地黄丸的鉴别 第四节 荧光鉴别法 (Fluorescence) 一、原理一、原理 荧光鉴别法是利用制剂中某些成分,如 黄酮类、蒽醌类、香豆素类等在可见光或 紫外光照射下能产生一定颜色荧光的性质 ,对中药制剂进行鉴别。有的成分本身不 具荧光性,但加酸、碱处理后,或经其它 化学方法处理后也可产生荧光供鉴别用。 二.特点二.特点 本法操作简便、灵敏,具有一定的专 属性。例如大黄和土大黄 ,前者显棕色 至棕红色荧光,而后者显亮蓝色荧光, 很容易区分。 三、操作方法三、操作方法 取中成药的提取液点加于滤纸上或加入蒸发皿中 ,置紫外光灯(365nm)下约10cm处观察所产生的 荧光。必要时可在供试品上加酸、碱或其它试剂,再 观察荧光及其变化。 四、注意事项四、注意事项 ① 荧光强度较弱,故一般需在暗室中观察荧光。 ② 供试液一般用毛细管吸取,少量多次点加在滤纸上,使 斑点集中且具有一定浓度。 ③ 紫外光对人的眼睛和皮肤有损伤,操作者应避免与紫外 光较长时间接触。 五、应用实例(五、应用实例(P59P59)) (一)元胡止痛片 (二)五味麝香丸 (三)热炎宁颗粒 第五节 薄层色谱鉴别法 (Thin Layer Chromatography TLC) 一、原理一、原理 基于相同物质在同一的色谱条件下,表现出相同的色 谱行为这一基本规律,在同一块薄层板上点加供试品和 对照物,在相同条件下展开,显色检出色谱斑点后,将 所得供试品与对照物的色谱图进行对比分析,从而对药 品进行定性鉴别。 二、特点二、特点 (一)简便、快速、易普及、具有分离和分析双重功 能,且采用共薄层对照分析法,故专属性亦较强。 (二)系统适用性试验。(05版药典新增) 1.检测灵敏度 2.分离度 3.重复性 1.检测灵敏度 主要用于限量检查.采用供试品溶液和对照 品溶液与稀释若干倍(10倍)的对照品溶液 在规定的色谱条件下,于同一块薄层板上点 样、展开、检视,后者应显示清晰的斑点。 2.分离度 用于鉴别时,对照品溶液与供试品溶液中 相应的主斑点,应显示两个清晰分离的斑点 。用于限量检查和含量测定时,要求定量峰 与相邻峰之间有较好的分离度,除另有规定 外,分离度应大于1.0。 分离度(R)的计算公式为: R=2(d2-d1)/W1+W2 式中 d1为相邻两峰中后一峰与原点的距离; d2为相邻两峰中前一峰与原点的距离; W1 及W2为相邻两峰各自的峰宽; A B W1W2 d1 d2 3.重复性 主要用于含量测定.即同一供试品溶液在同一块薄 层板上平行点样的待测成分的峰面积测量值的相对 标准偏差(RSD)应不大于3.0%;需显色后测量的相 对标准偏差应不大于5.0%。 (三)对照物的设置 对照物分为对照品(主要为有效成分和特征性成分的 单体)、对照药材和对照提取物三种。 对照物的设置有四种方式: ①设置一种或数种对照品 ②设置对照提取物 ③设置一种或数种对照药材 ④同时设置对照品和对照药材(“双对照”),它要 求样品色谱图中的主斑点应与对照品和对照药材色谱图 中的有关斑点相一致,从而大大提高了薄层色谱鉴别法 的专属性和整体性,可有效地检出药品是否使用了假冒 药材. (四)TLC已广泛用于中药材及其制剂的检验,成为中 药鉴别的重要方法和鲜明特色。 (五)中国药典大多数品种采用硅胶薄层色谱法,少数 使用聚酰胺薄层色谱法和氧化铝色谱法。 薄层色谱法还可用于药品的杂质检查和含量测定。 三、影响薄层色谱鉴别的主要因素三、影响薄层色谱鉴别的主要因素 影响因素较多,例如供试液的净化程度,吸附剂 的性能和薄层板的质量、点样(原点)的质量、展 开剂的组成和饱和情况、对照品的纯度、展开的距 离、相对湿度和温度等。重点介绍展开剂、相对湿 度、温度和pH值的影响。 四、仪器与材料 (一)薄层板 1.市售薄层板(亦称预制薄层板) 除另有规定外,一般要求使用市售薄层板 。市售薄层板分普通薄层板和高效薄层板两 种。常用的有硅胶薄层板、硅胶GF254薄层板 、聚酰胺薄层板、氧化铝薄层板等。 2.自制薄层板 在保证色谱质量的前提下,如需对薄层板进行处理和化学改 性,以适应供试品分离的要求时,也可用实验室自制的薄层板 ,除另有规定外,玻板可用10cm×10cm、10cm×15cm、 20cm×10cm、20cm×20cm不同规格的,最常用的固定相有 硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254等。其颗粒大小, 一般要求直径为10~40μm。薄层板采用湿法制备,即使用涂 布器将制好的固定相糊均匀涂布于玻板上。所用涂布器应能使 固定相在玻板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。涂布器有 手动、半自动、全自动等类型。 不同规格的薄层板 铺制薄层板 (二)点样器材 为了增强药品定性鉴别的可比性,中国药典规 定采用定量点样。最常用的是微升毛细管(定容 毛细管),为了提高点样效率和质量,还可用点 样辅助设备,如点样支架、半自动或自动点样器 。 (三)展开容器 应使用专用的展开缸,展开缸有水平式及直 立式两种类型。上行展开一般使用直立展开缸 ,它又分为平底式和双槽式,双槽展开缸具有 节省溶剂、便于预平衡、可控制展开箱内的湿 度等优点。 展开缸盖子应能密闭,体积应与薄层板大小 相适应。不能用生物标本缸等其它玻璃器皿作 为展开缸,否则影响展开质量。 全自动点样仪 微升毛细管 双槽展开缸 (四)显色(检视)装置 展开后的薄层板,一般需采用相应的显色(检视) 方法使板上的被检成分斑点显色。 喷雾显色应使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器,要求用压 缩气体使显色剂呈均匀雾状喷出; 浸渍显色可用专用玻璃器皿或适宜的展开缸做为浸渍 槽; 蒸气熏蒸显色可在双槽展开缸或大小适宜的干燥器中 进行;荧光检视装置为装有可见光、254nm及365nm紫外 光源和相应滤光片的暗箱,可附加摄像设备供拍照图像用 ,暗箱内光源应有足够的光照度。 喷雾显色 荧光显色 五、操作方法五、操作方法 一般操作步骤为: 薄层板制备(制板)→点样→展开→显色与检视 (一)薄层板制备 1.市售薄层板 临用前一般应在110℃活化30分钟。聚酰胺薄膜不需 活化。如在贮放期间被空气中杂质污染,使用前可用三氯甲烷 、甲醇或二者的混合溶剂在展开缸中上行展开预洗,110℃活化 ,放干燥器中备用。 2.自制薄层板 除另有规定外,将1份固定相和3份水(或0.2﹪ ~ 0.5﹪ 羧甲基纤维素钠水溶液)在研钵中向同一方向 研磨混合,去除表面的气泡后,倒入涂布器中,在玻 璃板上平稳地移动涂布器进行涂布,取下涂好薄层的 玻璃板,置水平台上室温下晾干后,在 110℃烘 30分钟活化,立即置干燥器中备用。薄层板一般要 求新鲜制备,当天使用。使用前应在反射光及透射光 下检查其质量,若板面不均匀、不平整或有麻点、有 气泡、有破损及污染等情况,应弃去不用。 (二)点样 1.供试品溶液的制备 主要采用浸渍法、回流以及超声等方法提取,液液萃取法或 固液萃取法进行精制。有的成分在药品中是以苷或酯等结合态 存在,检验前需水解成游离态再与相应的对照品一同展开分离 、鉴别。 如万应锭中熊胆的鉴别、定坤丹中人参和三七的鉴别和牛黄 上清丸中大黄的鉴别。 2.原点的点加 除另有规定外,在干燥洁净的环境,用专用毛细管 或半自动、自动点样器械点样于薄层板上形成原点。 原点一般为圆点状或窄细的条带状。原点基线距板底 边10~15mm,高效板原点基线离底边8~10mm。圆 点状原点直径一般不大于3mm;条带状的宽度一般 为5~10mm。高效板条带宽度为4~8mm,原点间距 离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜,一般不少于 8mm,高效板样品间隔不少于5mm。毛细管接触点 样时应少量多次点加,才能保证原点小而圆。还需注 意勿损伤薄层表面,点加条带原点时应注意条带的均 匀性,用喷雾状条带点样器,可保证点样的质量。 ≥8mm 原点起 始线 ≥5mm 8~15cm 1~1.5cm 溶剂前沿 展开剂 液面 (三)展开 点样后的薄层板放入加有展开剂的展开缸中,密闭,一般采 用上行一次展开。薄层板浸入展开剂的深度以液面距原点5mm 为宜,溶剂前沿达到规定的展距后,取出薄层板,晾干,待检 测。一般上行展开8~15cm,高效板上行展开5~8cm。必要时 可进行二次展开或双向展开。 例如,益气养血口服液中陈皮的薄层鉴别即采用二次展开, 先以乙酸乙酯-甲醇-水-吡啶(100︰17︰13︰5)展至3cm ,取出晾干;再以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水(20︰10︰1︰1 上层)展至8cm,取出晾干。 展开前一般需用展开剂对展开缸进行预平衡,即使 缸内展开剂气液两相达到动态平衡,该过程亦称“饱 和”。为此可在展开缸内加入适量展开剂,密闭,保 持15~30分钟。预平衡后,迅速将薄层板放入展开缸 中,立即密闭,展开。若薄层板需同时预平衡,可将 点样后的薄层板放入双槽展开缸的一侧槽中,另一侧 槽中加入展开剂,如上法预平衡后,再将展开剂移入 放有薄层板的槽中,展开。展开剂要求新鲜配制,不 要多次反复使用。展开剂配制后若分层,则应按要求 放置分层后取需要的一相(上层或下层)使用。 (四)显色与检视 1.颜色较深的成分可直接在日光下检视其斑点。 2.无色或浅色的成分多用喷雾法或浸渍法以适宜的显色剂显 色,或再加热使之显色,在日光下检视。 3.有荧光的物质或遇某些试剂可激发荧光的物质可在紫外灯 (365nm)下观察荧光色谱。 4.有的成分可用试剂的蒸气熏蒸(如碘蒸气、氨蒸气)显色 。 5.某些无色有紫外吸收且不产生荧光的成分可用荧光淬灭法 显色。即在含有荧光剂的硅胶板(如硅胶GF254板),在紫外 光灯(254nm)下观察板面上该成分形成的荧光淬灭色谱。 GF254薄层板 GF254薄层板在荧光灯下 荧光淬灭法的GF254薄层板 六、记录六、记录 薄层色谱图象可采用摄像设 备拍照,以光学照片或电子 图象的形式保存。也可以用 扫描仪记录相应的色谱图。 薄层色谱数码 相机成像系统 七、结果判断七、结果判断 供试品色谱中,在与对照品、对照药材或 对照提取物色谱的相应的位置上,显相同颜 色或荧光的斑点,则判断为符合规定。 八、应用实例八、应用实例 (一)六味地黄丸中牡丹皮的鉴别 1.丹皮酚;2~5.六味地黄丸 1~12.一捻金;13.人参二醇+人参三醇 (二)一捻金中人参的鉴别 (三)龟龄集中人参的鉴别 1~4.龟龄集;5.人参对照药材; 6.人参皂苷Rb1(S1)、Re(S2)、Rg1(S3) (四)万氏牛黄清心丸中黄连的鉴别 1~5.万氏牛黄清心丸; 6.黄连对照药材;7.小檗碱 (五)华佗再造丸薄层色谱图 (喷显色剂前的)(喷显色剂后的) 1.12.吴茱萸对照药材; 2.11.川芎对照药材; 3~10.华佗再造丸 第五节 紫外-可见光谱鉴别法 (Ultraviolet and Visible Spectroscopy) 一、原理一、原理 某些中药或中成药经适当处理后,所得紫外吸收光谱是由其 各组分的特征吸收叠加而成的。若将中药制剂作为一个特定的 整体,在一定测试条件下,只要各药味及其成分的组成与含量 相对稳定,则其紫外吸收光谱具有一定的特征性和重现性,可 以用于定性鉴别。 两组分的加和紫外吸收光谱 二、特点二、特点 分光光度鉴别法简便、灵敏、易普及。 但由于紫外光谱分辨率较低,图谱简单,某些不同的样品 可能给出极其相似的光谱图,使其在实际工作中受到一定的 限制。如果对样品进行前处理,除去干扰成分,则可有效地 提高该法的专属性。 中国药典仅有少数中成药品种收 载了分光光度鉴别法,例如,木 香槟榔丸等。 中国药典规定以最大吸收波长 (λmax)做为鉴别参数。样 品吸收峰波长应在该品种项下 规定的波长±2nm以内。 复方丹参片紫外谱线组图 三、操作方法(三、操作方法(P77 P77 自学)自学) 四、注意事项(四、注意事项(P77 P77 自学)自学) 五、结果判断五、结果判断 将供试品最大吸收波长和药品标准的规定进行 比较,二者如果一致,则判定为符合规定。 六、应用实例六、应用实例 木香槟榔丸 处方:木香、槟榔、枳壳、陈皮、青皮(醋炒)、 香附(醋制 )、三棱(醋制)、莪术(醋制) 取本品粉末4g,置蒸馏瓶中,加水10ml,使供试品 湿润后,水蒸汽蒸馏,收集馏液约100ml,照紫外分 光光度法(中国药典附录V A)测定,在253nm波长 处有最大吸收。(检出挥发性成分) 第六节 气相色谱鉴别法 (Gas Chromatography GC) 一、原理一、原理 在一定的色谱条件下,相同的物质应具有相同的色谱特性 (分配系数)和色谱行为(保留值)。因此,在同一色谱条 件下,将供试品溶液和对照品溶液分别注入气相色谱仪,对 二者的气相色谱图进行比对,根据供试品是否给出与对照品 保留时间相同的色谱峰,从而对样品作出定性分析。这种方 法可称为保留时间比较法,中国药典即采用此法对某些中成 药进行真伪鉴别。保留时间(tR)系指从进样开始,到该组 分色谱峰顶点的时间间隔。 色谱峰示意图 二、特点二、特点 气相色谱法具有高分辨率,高灵敏度、快速、 准确等特点,尤其适合分析制剂中的挥发性成分, 如麝香酮、薄荷醇、冰片、水杨酸甲酯等。一般情 况下气相色谱不适合分析蒸汽压较低的也即挥发性 较小的成分,因此该法在实际工作中具有一定的局 限性。 三、操作方法(自学)三、操作方法(自学) 四、注意事项(自学)四、注意事项(自学) 气 相 色 谱 仪 五、结果判断五、结果判断 比较供试品与对照品色谱图,供试品呈现与对照 品保留时间相同的色谱带,则判断为符合药品标准 规定。所谓保留时间相同是指基本相同,彼此相差 百分之几秒是允许的。 六、应用实
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