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第二章TEM原理与结构new

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生物电子显微技术 第二章 透射电镜的结构与成像原理 生物电子显微技术 第一节 透射电镜的结构 一、电子光学系统 二、真空系统 三、供电系统(电子学系统) 生物电子显微技术 电子光学系统 真空系统 供电系统 三大部分 TEM的基本构造 生物电子显微技术 电镜的组成(一) 生物电子显微技术 电镜的组成(二) 生物电子显微技术高压电缆 电子枪室 第一、二聚光镜 光阑 样品臂 物镜 中间镜 投影镜 观察窗 荧光板 底片盒 TEM剖面图 观察室 生物电子显微技术 (一)、电子枪 1、电子枪结构 1) 自给偏压式三极电子枪 阴极:尖端发射电子 栅极:控制电子束形状和发射强度 阳极:加速电子、调节电子波长 一、 电子光学系统 生物电子显微技术 电子枪典型结构的主要部件图 生物电子显微技术 电子束形成示意图 生物电子显微技术 灯丝加热温度和发射电流之间的关系 T I 生物电子显微技术 1、电子枪结构 2) 场发射电子枪 阴极:钨丝针尖阴极,其曲率半径 1000Å~2000Å。 第一阳极:相对于阴极有一正压, 引发阴极场发射并控制发射电流强 度。 第二阳极:加速电子、调节电子波 长 生物电子显微技术 场发射式电子枪 生物电子显微技术 名词: 场发射:在金属表面加上极强的电场之后,金属 表面势垒降低,在隧道效应的作用下,金属内部的 自由电子穿过势垒从金属表面发射出来,向真空飞 去,这种物理现象称为场发射 场发射电子枪特点:亮度高;交叉光 斑小,直径1 µm,最小30-100Å;能量 分散小;寿命长,给定寿命2000小时 (实际可用3年左右);分辨率高,高 分辨率的TEM和SEM都采用。 生物电子显微技术 1). 钨丝阴极:热电子发射, 最小交叉斑直径 10~50µm , 寿命20-25h,最长约200h 2). LaB6阴极:低温热电子发射亮度高, 寿命约 1000h 2、电子枪从材料可以分为: 生物电子显微技术 1、磁透镜的汇聚作用 2、汇聚作用结论: »磁透镜总是汇聚透镜 »磁场稍有变化,焦距f则有较大变 化,磁场强度越强焦距越短透镜的放大倍数 越高。(焦度1/f∝Hz2),且 »电子加速电压越高,电子速度越快 ,电子越不被易折射,焦距f就越长 (二)、磁电子透镜 生物电子显微技术 Hr:磁场 强度的径向 分量 Hz:轴 向分量 1-3 r Fz∝r 生物电子显微技术 生物电子显微技术 几何光学作图法 生物电子显微技术 1). 聚光镜 :汇聚电子束,控制束斑的大 小 控制孔径角 •第一级聚光镜C1:短焦距强磁透镜 •第二级聚光镜C2:长焦距弱磁透镜 2). 物镜 •作用:形成样品第一级放大的像; 改变其焦距f,对象进行精确 聚焦. •类型:短焦距强磁透镜 3、TEM的磁透镜 生物电子显微技术 3).与物镜相关的装置 A.物镜极靴 保证磁场的轴对称,防止磁饱和,减少磁场能量的浪费 B.物镜可动光阑 30,50,70 µm 控制物镜孔径角、减小球差 、增强像的反差 C.物镜消像散器 消除像散,提高物镜分辨率 D.物镜的散热装置 维持物镜低恒温,减少物镜热漂移 30,50,70 µm 生物电子显微技术 电子束 极靴 电磁线圈 电磁线圈 物镜极靴纵面图 生物电子显微技术 带极靴的磁透镜 生物电子显微技术 生物电子显微技术 生物电子显微技术 4). 中间镜和投影镜 中间镜 类型:长焦距弱透镜 倍率可变 M50~70nm),散射反差为主 小结构:(tf1时: AB面正焦,CD欠:CD正,AB欠 分类:残余像散(用消像散器消除), 二次像散(清洗) 消像散器的工作原理:在透镜磁场中,用消散 仪产生一个弱的柱面磁场,并调节它,使之与要校 正的像散大小相等、方向相反,从而抵消残余像散 。 生物电子显微技术 生物电子显微技术 生物电子显微技术 ◎畸变:由于透镜边缘部分比中心部分的聚焦能力强, 致使物体上各点像的放大倍数,随着物点离轴 的径向距离的不同而变化 畸变程度: (△Rd)=Cd*R03 分类: –桶形畸变:Cd0,离轴越远,物点放大倍数↗ –旋转畸变:由于球差的存在使电子束角度随着 离轴距离而变化 –扭曲畸变: (桶或枕)+旋转 注: 畸变只是像的比例失调,图像是清楚的 生物电子显微技术 生物电子显微技术 ◎ 色差: (波长差) 定义:由于电镜加速电压波动导致电子束波长发 生变化,使得入射电子速度不一致,与速 度 相应的电子波长也有一定的分散度,从而 引 起的一种像差。 原理: V↗,↘, ↗ , 电子越不易折射,焦距f大↗ V↘ , ↗ ,↘ ,电子越易折射,焦距f小↘ 同理: (光镜) 红光偏折最小,红光焦长 紫光偏折最大,紫光焦短 分类: 中心色差,放大色差,旋转色差, 放大旋转色差 生物电子显微技术 生物电子显微技术 形成色差的原因: △f =Cc(△V/V- 2△I/I) 式中: △f:焦差; Cc:色差系数 △V/V:加速电压相对起伏 △I/I:透镜激励电流相对起伏 –加速电压的变化 –透镜激励电流变化 –电子与样品的交互作用 减小色差的方法: –稳定加速电压和透镜激励电流10-6/min ,减小光阑直径(即孔径角) –样品做薄,提高加速电压,使电子穿过样 品的速度变化小。 –采用电子速度过滤器,减少参与成像电子 速度分布 生物电子显微技术 C. TEM最佳分辨率 电镜的分辨率主要取决于物镜的分辨率 物镜的分辨率取决于: –衍射差:d=0.61/nsin=0.61  /  –球差: s=Cs3 –色差、像散:可以忽略 只考虑衍射差和球差的综合效应 最佳=1.1(/ Cs)1/4 opt=0.65(Cs 3) ¼ 最佳=0.2nm 生物电子显微技术 生物电子显微技术 实际= (s2+ d2+ a2+ c2)1/2 一般TEM=0.5~1nm (二) 有效放大倍数: –植物细胞直径100m –动物细胞10~20 m –细菌的直径1 m –病毒直径10~100nm –生物大分子1-10nm –小分子0.1~1nm –原子直径0.1nm M有效= 肉眼/仪器 生物电子显微技术 二 透射电镜的其它性能指标 1. 场深:也称景深,指在保持像清晰度的条件下,物面允 许移动的距离。 Dfi=/ 特点:⑴场深大, 可达1 m ⑵容易聚焦,物面位置允许有Dfi长度的误差 ⑶对于厚度小于场深的样品,都能获得高分辨率 图像,尤其适合复型样品;但同时也导致图 像 上下叠加背底昏暗 2. 焦深:在保持像清晰度的条件下,像面许移动的距离 Dfo=M2* Dfi 特点:焦深大,M=500时,500m,最大可达10000m 照相时非常方便 生物电子显微技术 生物电子显微技术 三 适用于透射电镜的样品 1. 从样品类别上分: –超薄切片 –冷冻蚀刻的复型膜 –悬浮样品的滴片 –直接培养的单层细胞 2. 从研究内容上分 –免疫电子显微技术 –电镜放射自显影技术 –电镜细胞化学技术 –X-ray微区分析 生物电子显微技术 免疫电子显微镜技术的定义: (Immune Electron Microscopy: IEM)又 叫免疫电镜细胞化学技术,就是将免疫化学技 术与电镜技术有机地结合起来,研究抗原抗体 相互作用的一种方法。抗原抗体之间的相互作 用具有较高的特异性,相互作用后,可直接形 成或通过某种标记物形成大分子复合物或聚合 物。该生成物具有电子致密性,在电镜下可以 观察到,又不影响免疫反应的特异性。那么, 就可以在细胞超微结构水平上或分子水平上研 究免疫作用。这种在很高分辨本领电镜下非常 精确地显示抗原所在位置的方法称为~ 生物电子显微技术 免疫电子显微镜技术的原理: • 用化学方法将不同大小的金粒与特异性抗体球蛋白 在不影响特异性蛋白质免疫特性的前提下结合起来 ,制备成金标抗体(GA)。当GA与相应的抗原(直接法 )或抗原—抗体复合物(间接法)相遇时,即结合形成 免疫金复合物,可用透射电镜观察反应结果:有金 粒的地方,即为抗原或抗原—抗复合物存在的地方 。 • 不同抗原肽以不同种动物供体来的相应标记抗体顺 序反应,可在同一组织切片中标记两种抗原肽。抗 体以小金粒标记,另一抗体以大金粒标记,在透射 电镜下很容易将两者区分开来。 两种抗原肽分别与 来自不同种动物供体的抗体发生反应,兔初抗用小 粒金标记的猪抗兔IgG检测;而豚鼠初抗IgG用大粒 金标记的兔抗豚鼠IgG检测。 生物电子显微技术 举例: 验证植物的胞间连丝组分中,是否有actin(肌 动蛋白)和 myosin(肌球蛋白)的存在。 生物电子显微技术 VAP (6-nm gold particles) and MP (18-nm gold particles) A coiled-coil interaction mediates cauliflower mosaic virus cell-to-cell movement Livia Stavolone, Maria Elena Villani, Denis Leclerc, and Thomas Hohn PNAS April 26, 2005 vol. 102 no. 17 6219–6224 生物电子显微技术 作业 1. 名词解释:分辨率 振幅差 场深 焦深 § 透射电镜主要由哪三大系统组成?其中每个 系统主要包括哪些部分? 3. 透射电镜工作时为什么要求真空? 4. 电子束与样品相互作用后产生哪些信息?其中 又有哪些信息与透射电镜的成像有关? 5. 生物样品的反差有什么特点? 怎样提高生物 样品的反差 6. 简述透射电镜的基本成像过程。 7. 透射电镜有哪些主要性能。 生物电子显微技术 透射电镜有哪些主要性能: TEM是以电子束作为照明光源的; 装有聚光镜、物镜、中间镜、投影镜一 系列电磁透镜;其分辨率可达 0.1~0.2nm;有效放大倍数可达100万左右 ;散射反差和位相反差在其成像反差起 主导作用;在放大500倍时其焦深为500 m,场深可达1 m ;图象用荧光板 显示,且无色彩;适于100nm的超 薄切片、复型膜等;要求样品在真空 条件下成像。
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