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第二章菌种地选育

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第二章 菌种选育 第二章菌种选育 第二章菌种选育第 第二章 菌种
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第二章菌种的选育 内 容 1.菌种的来源 2. 菌种的选育 3. 菌种的保藏 2.1 菌种的来源 微生物具有的五大特性 1.种类多,分布广; 2.比面积大,代谢能力强; 3.生长迅速,繁殖快; 4.适应性强,容易培养; 5.易变异. 2.1.1生物物质产生菌的筛选 2.1.1.1微生物---生物产物的来源 两个成功因素 1.产生菌的选择; 2.合理的筛选方案 几百倍 选择性灵敏度 2.1.1.2 待筛选样品的性质 l新产物的代谢类型 l生产工艺方式 2.1.1.3 筛选方案的设计 三种基本的筛选方法: 1. 整体生物; 2. 完整细胞; 3. 亚细胞制剂 举例1: 抗细菌的筛选—琼脂扩散法: 1.试验菌的制备 金黄色葡萄球菌 ATCC6538P 摇瓶培养 调节菌体浓度 OD660为0.3 2.琼脂板制备 琼脂培养基 冷却至45~50℃ 倒平板 灭菌 1% 试验菌 冷却或至4℃保存 4.琼脂板鉴定 或 或 打孔 对照 样品 标准抗生素 供试样品 培养抑菌圈观察 举例2.抗癌筛选 机理 许多天然化疗药物是通过使肿瘤细 胞的DNA损伤而治疗的作用。 方法建立: 1.λ噬菌体诱导检测诱导检测 系统统:当 大肠肠杆菌溶素原受阻遏状态态下的 λ原噬菌体因DNA的损伤而释放 出来,通过平板法检测完整噬菌 体颗粒的生长情况可作出DNA受 损情况判断。 2.生化诱导BIA法 利用一种特别的λ溶素源,在DNA 受到损伤时并不释放出病毒颗粒而是形 成ß-半乳糖苷酶。可以通过检测过检测 酶的 化学反应应加以判断。 分析步骤(BIA) 1. 指示菌 大肠杆菌BR513(ATCC33313) 2.指示微生物培养 3.指示微生物倒固体检测平板 4.将待测发酵液少量(20ul)涂平板 5. 加入ß-半乳糖苷酶的生色基质混合物 (84mg褪蓝RR和14mg6-溴-2萘-β-D- 半乳糖吡喃糖苷于2ml二甲基亚砜亚砜 中 ),再加入琼琼脂静置,观观察颜颜色变变化 情况。 6.结结果分析 2.1.2 微生物选择选择 分离的原理和发发展 选择分离的五个步骤: 1.含有微生物材料的选择 2.材料的预处理 3.所需菌种的分离 4.菌种的培养 5.菌种的选择和纯化 (1)确定研究目标,了解微生物资源状况; (2)掌握物种分布,明确采样材料; 研究目标和微生物资源资料确定待 选种子的类型。如研究抗菌素,可 选择放线菌、真菌、细菌 依照资料或专家介绍,结合自己所 掌握的知识及工作经验,明确待选 种子在自然界的分布情况,确定采 样目标。 (3)根据待选种子的生理学与生态学 特性,确定培养基,选择培养条件与 方法。 (4)在上述准备工作完成之后,制定具 体的筛选方案与操作步骤: 进行综合、具体问题分析来决定。 2.1.2.1 微生物材料的选择 采样时要注意的问题 q 气候、水分、空气 q 来源要广 q 结合产品的特点 q 标签:地点、时间、气候等 采土地点 铲铲去表层层 土 5~15cm 取几十克装入 无菌袋中 扎袋,记录时间记录时间 、地 点和环环境情况 尽快分离 2.1.2.2材料的预处理 如果所需菌种较多可直接分离,如 果菌体较少怎么办? 1. 物理法:加热、过滤、离心等方法 2. 化学法:加入一些基质。 3.诱饵法: 诱饵技术:将固体基质加到待测的土壤或 水中,待其菌落长成后在涂平板. 2.1.2.3 所需菌种的分离 为了提高分离效率选择合适的培 养基、选择性抑制剂的选择、培养 条件控制等等。 采用给混合菌群提供一些有利于所需 菌种或不利于其它菌型生长条件以促使所 需菌株大量繁殖,从而利于分离它们,所 谓的增殖培养。 富集的目的:让目的微生物在种群中占 优势,使筛选变得可能。 Ø 富集的三种方案: q 定向培养:采用特定的有利于目的 微生物富集的条件,进行培养。 q 当不可能采用定向培养时,则可设 计在一个分类学中考虑. q 不能提供任何有助于筛选产生菌 的信息,这时只能通过随机分离的 办法. 定向培养的富集方法 1、底物 2、pH条件 3、培养时间4、培养温度 等一切能提高目的微生物相对生长速度的 手段,培养(固体、液体;分批连续)后 使目的微生物在种群中占优势。 2.1.2.4 菌种的培养 应该注意:各种菌种的培养条件和时间也 各不相同。 2.1.2.5菌落的选择 1.铺菌法;2.复印平板法。 q 从形态的角度 菌落的外观形态,是微生物的一个重要 表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生 长,从具有粘液性的菌落外观上就可以初 步识别。 q 从产物角度出发 在培养时以产物的形成有目的的设计培养基 利用简单、快速的鉴定方法,如抗生素 2.2 工业化菌种的要求 1. 能够利用廉价的原料,或使用来源丰富的原料. 2.菌体温度应适应较高的温度. 3. 遗传性能要相对稳定 4.菌对所采用的设备和生产过程的适应性 7. 产生菌及其产物的毒性必须考虑(在分类学上最好与致病 菌无关) 5.菌的产物得率和产物在培养基中的浓度 6.产物容易从发酵液(细胞)中提取 2.3 施加选择压力的分离方法 1.富集液体培养法: 连续培养菌种的筛选 比生长速率(u):每克菌体每小时增长的 菌体量.u=1/XdX/dt. 比生长速率u 基质浓度 B A r 限制性基质 培养液 当进行流加时基质浓度r时 ,,B菌先被洗出; 2.固体培养基的使用 主要适用于初级代谢产物菌株的筛选 实例:碱性纤维素酶产生菌的筛选(国家七五攻关项目) 文献:产生菌为中性芽孢杆菌,嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌 采样(造纸厂)→80度30分钟处理 0.0075%曲利本蓝+1%CMC(羧甲基纤维素),pH10.5 培养3~4天,选择有凹陷圈的菌落 从285个土样中获得62株 26株为组成型 36株为诱导型 ↓ 2.4 随机分离方法 1.抗生素产生菌筛选 2.药理活性化合物的筛选 3.生长因子产生菌的筛选 4.多糖生产菌的筛选 2.4 菌种选育 目的: 防止菌种退化 解决生产实际问题 提高生产能力 提高产品质量 开发新产品 2.4.1自然选育 自然选育:在生产过程中,不经过人工处理 ,利用菌种的自然突变而进行菌种的筛选 的过程. 自然状态下,碱基对发生自然突变的机率为10-8~10-9 自然突变有两种情况: 一种是我们生产上所不希望看到的,表现为菌株的衰 退和生产质量的下降,这种突变成为负突变。 另一种是我们生产上希望看到的,对生产有利,这种突 变成为正突变。 自然选育在工业生产上的意义 问题: 高产菌株是正突变高,还是负突变高? 回复突变:高产菌株在传代的过程中,由于自然突变导致 高产性状的丢失,生产性能下降,这种情况我们称为回复 突变 自然选育虽然突变率很低,但却是工厂保证稳产高产的 重要措施。 自然选育操作步骤: 一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。 单细胞(孢子)悬液的制备 平板分离 挑选单菌落(注意形态的观察) 发酵试验 2.4.2 诱变育种 用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选, 称为诱变育种 诱变剂:能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂 诱变剂{ 物理:紫外,快中子 化学:硫酸二乙酯,亚硝基胍 生物诱变剂 噬菌体 2.4.2.1 诱变育种的一般步骤见 (p38) 整个流程主要包括:诱变和筛选. 诱变育种中的几个注意问题 1.出发菌株的选择 出发菌株标准:产量高、对诱变剂的 敏感性大、变异幅度大。 待处理的菌悬液应考虑微生物的生理 状态、悬液的均一性和环境条件。一般要 求菌体处于对数生长期,并采取一定的措 施促使细胞处于同步生长,这样有利于变 异率提高得到很好的重现性。 2.复合诱变因素的使用 出发菌株通常有三种: Ø 从自然界分离得到的野生型; Ø 通过生产选育的菌株即自发突变选育 Ø 已经通过诱变选育的菌株. 对于不同出发菌株考虑采用不同的 诱变剂进行处理 3.剂量的选择 变异率与致死率有一定的关系,利 用致死率作为剂量选择的依据. 4. 变异菌株的筛选 初筛: 总结变异的菌落“形态”特性和产量 之间的关系. 根据平皿反应直接挑取高产菌株: 平皿反应:每个菌落产生的代谢产物与 培养基的指示物作用后的变色圈和抑制 圈等等. 常用方法:纸片培养显色法、透明圈法 、琼脂片法、浓度梯度法等等。 以上为产量型的筛选 营养缺陷型的筛选: 经过诱变后,经过中间培养,淘汰野生 型、检出营养缺陷型确定生长谱。 淘汰野生型的方法有:抗生素法、菌丝 过滤法、差别杀菌法和饥饿法等,其目 的是浓缩营养缺陷型。 营养缺陷型检查方法:逐个测定法、夹 层平板法、限量营养法等等。 5.高产菌株的获得与筛选条件的配合 出发菌株、诱变因素、筛选条件 2.4.3 物理、化学诱变剂的使用原理方法 1.紫外线:有效波长260nm左右;诱变 条件,一般选择15W紫外灯,距菌(孢 子)悬液30cm左右,在黑暗或红灯照射 环境下进行。 作用机制:形成胸腺嘧啶二聚体以改变 DNA生物活性,造成菌体变异甚至死亡 。 2. 快中子 快中子的生物学效应是由其撞击原 子核后产生的质子产生的。 能够引起较多的点突变和染色体变, 而产生诱变育种的效应。 3.氮芥(p40) 机理:氮芥的盐酸盐和碳酸氢钠 反应释放出氮芥子气,再与细胞作 用引起染色体发生畸变。 使用方法: Ø 活化剂和解毒剂的配置 Ø 氮芥的盐酸盐配置 Ø 诱变作用 Ø 诱变终止 4.亚硝酸 作用机制:脱去碱基中的氨基,引 起碱基对的转换作用从而造成突变。 5.N-甲基-N/-亚基胍(NTG) 对DNA起到烷化剂和亚硝酸的作用 。 6.航天育种 利用空间高真空、微重力和强辐射的 特点 2.5 抗噬菌体菌株的筛选 证明抗噬菌体突变在发生与噬菌体接触 之前的经典实验: 波动实验、涂布实验、影印实验。 2.5.1 抗噬菌体菌株选育方法: 1.自然突变; 2. 诱发突变。 2.5.2 抗噬菌体的特性实验 1.抗噬菌体性状的稳定性实验 点滴法、双层琼脂法。 2.抗性菌株的产量实验 3.真正抗性和溶原性的区别 2.5.3 噬菌体的防治 噬菌体的危害:引起发酵液变稀,引 起菌丝体变形,消解,发酵终产物积累停 止甚至下降. 怎样防治? 1.正确判断 2.普及有关噬菌体的知识 3.选育抗噬菌体菌株 4.消灭噬菌体 5.收集和保存噬菌体 2.6杂交育种 杂交育种:将两个基因型不同的菌株经吻 合(接合)使遗传物质重新组合,从中分离 和筛选具有遗传新性状的菌株. 杂交育种的目的 1.改变遗传物质基础,获得杂种菌株; 2.获得优良菌种,克服由于长期诱变造成 的菌株生活能力下降等缺陷; 3.扩大变异范围,改变产品质量和产量,甚 至出现新的品种; 4.促进遗传学理论发展. 营养缺陷性:微生物经诱变剂处理, 由于基因突变,失去了合成某种物质 的能力,不能在基本培养基上生长需 要补加一定种类的有机物质后才能 生长. 2.6.1 细菌的杂交育种 A-B+Lac-SMrT1s A+B-Lac+SMsT1r A-B+Lac-SMrT1sA+B-Lac+SMsT1r A+B+Lac+SMsT1r A-B-Lac+SMsT1r A+B+Lac+SMrT1s A+B+Lac+SMsT1s A+B+Lac+SMrT1r 等等组合型 细菌的杂交育种其他方式: F因子的转移、转化和转导等发 生基因重组的方式。 例如: F因子的转移:(Hfr) F+ Hfr + 2.6.2放线菌的杂交育种 链霉菌基因重组主要过程 亲本 亲本 混合菌丝体 异核体 亲本分离子 部分合子 异核系 重组体 v基因重组过程中的四种遗传体系: v1.异核体:在同一菌丝或菌体中存在不同基因 型的细胞核. 2.接合现象 供体染色体片段 和受体染色体相 结合形成了部分 合子又称半合子 3.异核系的形成 当部分合子形成后,就会形 成杂合的无性繁殖系。产生的孢 子多为单倍体。 如果没有发生染色体的重组不能 在基本培养基上生长。 分生孢子 4.重组体的形成 异核体菌落在生长过程中,染色体 重叠的两节段(二体区)的不同位置发 生交换后能 产生重组体孢子。 + 重组体 2.6.2.1放线菌的杂交技术 1.混合培养法 a.选择性平板法 b.异核系分析法 2.平板杂交法 3.玻璃纸转移法 成功报道:金霉素、土霉素、新霉素、红 霉素、新霉素等抗生素杂交育种方面。 2.6.3 霉菌的杂交育种 2.6.3.1准性生殖过程 Ø 形成异核体 Ø 杂合双倍体的形成(核融合或核配) Ø 体细胞重组(体细胞交换、分离和单倍 体化) 2.6.3 .2霉菌杂交技术 1.选择直接亲本 突变菌株 (遗传标记) 诱变 原始亲本 杂交 直接亲本 遗传标记的多样性: 营养突变型、抗药性突变型、形态突变型等。 遗传标记要求: Ø 菌体形态稳定 Ø 能在基本培养基上形成丰富的孢 子 Ø 不影响产量 Ø 在配对过程中容易形成异核体 2.异核体的形成(强制异合) 方法:完全培养基液体混合法、完 全培养基等方法(见P47). 3.双倍体的检出。 4.分离子的检出 2.6.4原生质体融合技术 原生质融合:把亲本的细胞壁在酶的作用 下瓦解,形成原生质体.两个原生质体在高 渗环境条件下,在助融剂的作用下,发生细 胞融合,基因组通过接触到交换,从而实现 遗传重组. 标记菌株筛选 原生质体制备 融合 再生 融合子选择 实用菌株筛选 2.6.4.1原生质融合的优点 1.诱变、遗传转化、原生质体融合 效率高; 2.能够得到多种类型的重组子; 3.重组频率高 4.可以和其他育种技术相结合 5.便于提高筛选效率 原生质体融合技术的应用 Ø 原生质体制备和再生过程引起产量突 变。 Ø 原生质体制备和再生过程引起质粒丢 失。 Ø 种内融合引起抗生素合成中限速酶得 到修饰 Ø 种间融合可能引起“沉默基因”的表达 。 2.7 DNA重组技术 DNA重组技术:按照人的意志,将某一 (供体)的遗传信息在体外经人工与载 体相接(重组),构成重组DNA分子, 然后转入另一生物体(受体)细胞中, 使被引入的外源DNA片段在后者内部得 以表达和遗传。 开辟了一个分子育种的新领域---分子育 种 分子育种:利用基因工程技术、原理和设备, 在分子水平上改良菌种。 2.7.1 优越性: 1.增加生物合成基因量而增加抗生素的产量; 2. 导入强启动子或抗性基因增加抗生素产量;] 3.两种不同基因在体外重组后再导入受体内可 以合成杂交抗生素; 4.激活沉默基因 5.把异源基因克隆到宿主中表达,以期彻底改 变生产工艺。 2.7.2 DNA重组技术的基本过程 1.目的基因的取得 有三种途径: Ø 从供体中直接提取 Ø 通过反转录取得cDNA Ø 化学合成特定功能的目的基因 2.优良载体的选择 Ø 具有一个自我复制能力的复制子 Ø 能在受体细胞内大量繁殖; Ø 最好只有一个限制性内切核酸酶的切口; Ø 必须有一种选择性遗传标记 3.目的基因与载体DNA的体外重组 采用限制性酶切或人为地在DNA的3́端接上 polyA和polyT可以使重组组的两个DNA分子 产产生“卯眼”似的粘性末端。然后两者在 5~6℃下“退火”形成新的双链,在连接酶的 作用下形成重组载体 4.重组体导入受体细胞 5.重组受体细胞的筛选和鉴定 筛选类别 遗传学直接筛选法:抗药性、 噬菌斑形成能力等 分子生物学间接法:酶切相对 分子量的大小、分子杂交等 举例抗药性变化检测: 质粒 Apr Tcr Apr + 含氨卞青霉素培养基含四环素培养基 6.工程菌的大规模培养 基因工程菌不稳定具体表现 Ø 质粒的丢失 Ø 重组质粒发生DNA片段脱落 Ø 表达产物不稳定 解决不稳定性对策 Ø 组建适当载体(质粒上插入 特殊DNA片段) Ø 选择适当宿主 Ø 施加选择压力(抗生素添加法、抗生素依 赖变异法、营养缺陷型法) Ø 控制基因过量表达 Ø 控制培养条件 Ø 改良质粒 Ø 固定化工程菌 2.8 菌种的保藏 2.8.1 意义:菌种保藏首先是菌种不死亡, 保持优良的生产性状。 2.8.2菌种保藏的原理和方法 原理:根据菌种的生理生化特点,人工创造 条件,使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降 低,以减少变异。 菌种保藏的几种方法: 1.斜面冰箱保藏法; 2.沙土管保藏法; 3.菌丝速冻法; 4.石蜡油封存法; 5.真空冷冻干燥保藏法 6.液氮超低温保存法 作业 通过查阅资料请你设计一套从自然界筛选构 建高产纤维素菌株的方法. 要求:1.
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