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免疫毒素

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免疫毒素
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免疫毒素抗肿瘤研究 导 言 Ø 恶性肿瘤是危害人类健康 的一类重要疾病 ,随着人类 生存 环境的恶化和社会压力的增大 ,恶性肿瘤的发病 率和病死率逐渐增高,每年全球癌症死亡人数约为700万 人。 Ø 肿瘤的治疗以外科手术为 主,以放化疗为辅 ,但放化 疗缺乏特异性 ,对正常组织器官的毒副作用较大,使患 者身心备受影响。 Ø 对肿瘤的特异性治疗一直是医学工作者的梦想。 Content 简介 发展及研究进 展 免疫毒素的构建例子 免疫毒素 一 免疫毒素简介 1. 概念 免疫毒素(immunotoxin)是以植物毒素或细菌毒素 为毒性分子 ,以抗体或细胞因子为载体分子的一类 蛋白质 ,是一种新型的抗肿瘤导向性药物 抗体或细胞因子 免疫毒素 毒素 弹头 通过与细胞表面抗原或者 受体结合,靶向导向肿瘤 细胞 进入肿瘤细胞内利用其毒性,攻击 肿瘤细胞,引起肿瘤细胞的死亡 载体 生物导弹 2. 免疫毒素作用机理 ①免疫毒素分子中受体结合域与靶细胞表面相应抗原或受体的结合; ②免疫毒素分子的转位结合域,通过内化和跨膜转运过程 , 转运到细胞质中 ③免疫毒素分子的催化结构域,通过胞内催化抑制蛋白质合成 ,或诱导凋亡 3.作为载体必须具备的条件 a) 对靶细胞具有高度特异性和亲和性。 b) 连接毒蛋白后既不丧失自身的结合性能又不影响毒蛋白的生 物活性。 c) 在体内运转过程中不被失活,具有相对的稳定性和较长的半寿 期。 d) 能携带毒蛋白有效地到达靶部位,并结合靶细胞,经内化后释放 出活性毒蛋白分子,具有特异杀伤作用 目前作为载体的主要是专一性单抗,此外也有报道 应用抗原、激素和受体等细胞因子为载体,它们均斌 于免疫毒素对靶细胞特异结合能力 4.不同毒素的作用机理 毒素蛋白 细菌毒蛋白 植物毒蛋白 白喉毒素、绿脓杆菌外毒素 蓖麻毒蛋白、相思子毒蛋 白、 槲寄生凝集素 ,蒴莲根 毒素等 Ø 植物毒素的作用机理 植物全毒素属于Ⅱ型核糖体失活蛋 白( RI P) , 由结合区和催化区组成 , 如蓖麻毒素( R T) 、 相思豆毒素 、 槲寄生凝集素 和蒴莲根毒素等。 植物半毒素属于 I型 RI P, 只含催化区, 如美洲商陆抗病毒蛋白( PAP) 、 皂草素 、 白树毒素和丝瓜毒素等 RIP切除真核细胞 28 S rR NA 第 4324位的腺嘌呤 4323位的 鸟嘌呤 EF--1/EF--2不能与 60S 核糖体亚基的结合 核糖体失活,蛋白质 合成受阻 植物毒素 诱导细胞调亡 只有当植物毒素的催化区单独进入细胞浆 中后才能发挥细胞毒作用 ,因此 全毒素在 转膜前需通过还原结合区和催化区之间的二 硫键而去除结合区。植物毒素是怎样从细胞 表 面进入胞浆中还不太清楚 ,不同植物毒 素的转膜过程可能不同 Ø 细菌毒素的作用机理 细菌毒素 细菌毒素的催化区域的 氨基酸序列使 EF --2发 生 ADP核糖基化 抑制蛋白质合成 细胞死亡 活化启动caspase 诱导细胞凋亡 破坏细胞膜,膜表 面形成小孔 细胞内含物外泄 细胞死亡 二 免疫毒素的研究进展 3. 免疫毒素目前存在的问 题 1.总体发展方向 2.分别对 于抗体和毒素 的研究 1. 免疫毒素总体发展 Ø 1970年,Moolten 和Cooperband 首先制得了第一个免疫毒素,此后40 年,许多生化和医务工作者对此作了大量深入研究, 取得了一定成绩 Ø 免疫毒素的发展大致分为三个阶段 第一代免疫毒素是化学交联免疫毒素 第二代免疫毒素是抗体或抗体的活性片段与 双链毒素A 链或单链RIP 的化学偶联物, 第三代免疫毒素是基因工程免疫毒素 将抗体功能区或生长 因子的基 因与突变形式的毒蛋白基因融 合后体内表达产生的 第一第二代免疫毒素与第三代免疫毒素的比较 免疫毒素第一代第二代第三代 结构组成完整的抗体与毒 素 抗体片段与改造 毒素 抗体片段与改造 毒素 制备方法体外化学交联体外化学交联宿主菌体内重组 表达 优缺点稳定性差、分子 量大、免疫原性 强、渗透性差 稳定性差、分子 量大、免疫原性 强、渗透性差 稳定性强,渗透 性好,特异性更 好,制备时简单 易行,可短期内 大量制备 2.分别对于抗体,毒素和其他方面的研究进展 Ø 对抗体的研 究 单克隆抗 体 单链的可变区 片段免疫毒素 (scFV immunotoxin) 双链的FV免疫 毒素( dsFVimmunoto xin) 完整Ig分子量大,渗透性差,应用过程中受 到一定的限制 FV是能介导特异性结合的最小抗体亚单 位。在轻链和重链可变区用一个连接肽连接 ,保留其稳定性的同时充分保留了特异性结 合能力,且免疫原性大大降低 通过二硫键相连,scFV与dsFV免疫毒素的体 外实验显示,两者活性及特异性相似,但 dsFV的产量高,对热和化学处理有耐受作用 ,在各种缓冲液及人血清中较稳定 Ø 对于毒素的研究 制备免疫毒素最常用的毒素有白喉毒素、蓖麻毒素、假单胞杆菌外毒素和 其它毒素。 (1)蓖麻毒素(ricin)改造 蓖麻毒素 A链 B链 含催化区 含半乳糖结合位点 能与所有动物及人体细胞结合 ,从而失去免疫毒素导向治疗 的目的 其一是用半乳糖封闭B链上的半乳糖结合位点; 其二是直接应用A链制备免疫毒素 (2)白喉毒素(diphtheria toxin,DT)改造 白喉毒素 C区 T区 R区 N端催化区,发挥毒性 跨膜区 C端受体结合区 删除R区的DT分子毒 性并未受影响,同时 除去受体区,也失去 了与机体正常细胞结 合的能力,避免了 DT的非特异性细胞 毒性作用 删除R区,保留C区和T区,拼接上 有特异性识别作用的抗体或其它分 子 注:对毒素分子的改造都是 基于对毒素分子结构研究清 楚的基础上,不同的毒素分 子的改造方法是不同的 Ø 其他方面的研究 a) 免疫毒素在体内的清除及降低其清除速度的研究 b)免疫毒素在小鼠体内应用的研究 应用免疫毒素的重要目的是治疗肿瘤。应用中一个令人关心的 问题是它的体内清除,降低免疫毒素在体内的清除速度,延长 其半衰期,在免疫毒素的应用研究中具有重要的意义 Thorpe等(1985)发现用高碘酸处理,并经氰硼氢化钠还原的蓖 麻毒素,发现毒素在小鼠体内的清除速度,不像天然毒素那么 快。修饰过的毒素对培养细胞的毒性仅及天然毒素的1/10,但 在动物体内其毒性却是天然毒素的4倍 毒素在小鼠体内的药物动力学、对肿瘤的定位能力以及治 疗肿瘤效果的研究,是免疫毒素应用于临床的重要研究方 面 3. 免疫毒素在体内肿瘤治疗的中的问题 ①特异性:免疫毒素的特异性是进行导向治疗的前提,它取决 于所用载体如抗体或细胞因子的特异性;寻找肿瘤细胞表面特异 性表达的受体或抗原 ②活性:取决于其半衰期与稳定性,而半衰期与稳定性则取 决于免疫毒素的大小及其与肿瘤的亲和力,研究如何使免疫 毒素有较长的半衰期和较好稳定性也是急需解决的问题 ③毒性:对毒素分子和运载体进行克隆修饰,降低其非特 异性细胞毒性作用 ④免疫原性:主要取决于毒素部分,多年的临床试验表明,50% ~100% 的实体瘤病人和 0~40%的血液瘤病人在经 过一轮的免疫毒素治疗后 , 会产生针对免疫毒素的抗体 。当产生的抗体为中和性抗体时 ,免疫毒素 的细胞毒作用就会降低,设法尽量减小免疫原性。 尽管免疫毒素导向治疗肿瘤尚存在一些问题,但已显示出很大 的临床应用前景。随着蛋白质及基因工程技术的深入研究,免 疫毒素导向治疗恶性肿瘤必将成为行之有效的治疗手段 ⑤毒副作用:最常见的副作用为血管渗漏综合征(vesselleak syndrome, VL s)这是因为免疫毒素从血管到达靶器官必须穿过血管内皮细胞,还有 对肝脏毒性 , 这是Fv的残基 与带负电荷的肝细胞结合导致的 三 免疫毒素的构建 PCR扩增毒素基因 毒素基因与载 体连接 与毒素连接的载 体与抗体或细胞 因子连接 PCR 扩增抗体基 因 连接产物转化表 达宿主 重组免疫毒素 的诱导表达 目的蛋 白的分 离纯化 双酶切后露出相同 的粘性末端 IPTG可诱 导的Lac启 动子 信号肽肠激酶可 切割的 His10标 签 单链抗体改造后的毒素基因ETA 以分泌蛋白 的形式表达 ,直接释放 到胞外 诱导大量 表达 便于亲和层析纯化 Thank you Thank you Thank you Thank you ! ! ! !
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