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第二章电生理研究方法2012918

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第二章电生理研究方法2012918
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第二章第二章 心肌电生理学研究方法心肌电生理学研究方法 Methodology of Myocardium Methodology of Myocardium Electrophysiological ResearchElectrophysiological Research 电生理学技术的发展 1825年 电流计发明与应用 1922年 电子管放大器和阴极射线示波器问世 20世纪40年代 微电极技术产生 动作电位的钠学说 20世纪50年代 电压钳技术产生 20世纪70年代 膜片钳技术 谢灵顿 ( Sherrington) (1857-1952) 英国神经生物学家。 发现中枢神经反射活动规律 艾德里安 (Adrian ) (1889-1977) 英国生理学家。 阐明动作电位及其传导规律 1932年获诺贝尔奖 厄兰格 (Erlanger) (1874-1965) (美) 两人合作发明了阴极示波器,并研究了神经纤维的功能 加塞 (Gasser ) (1888-1963) (美) 1944年获诺贝尔奖 Hermann 变质学说(Alteration theory)。 1879年,他指出,在损伤的神经或肌肉中所出现 的负电位差,是发生于损伤一端的,后来进一步证明 了完全死亡的组织上是不产生这种负电位差的。这种 正常部位与损伤部位之间的电位差,称为损伤电位 (injury potential) 这种电流则相应地称为损伤电流 (injury current)Hermann认为,这种电流是损伤时 才产生的。因此当组织损伤时,在生理和化学作用的 影响下产生了局部的变质,因此与正常部位之间产生 了电位差。 Bernstein膜学说 1902年,Bernstein提出生物电发生的膜学说: “神经或肌肉的细胞膜只对钾离子有特殊的通透性, 而对较大的阳离子和阴离子则均无通透性,因此由于细 胞内外钾离子分布不均匀,在膜两侧就形成一个电位差 ,此即静息电位,神经冲动到来时,膜变为无选择通透 的膜,静息电位消失,动作电位因而产生。” Hodgkin和Huxley离子学说(动作电位的钠学说 ) 1940年前后,由于Hodgkin和Huxley在枪乌贼巨 轴突上发现动作电位大于静息电位的事实,膜两侧 溶液成分不同;膜对离子具有选择性通透性,这种 通透性在动作电位时发生改变。静息时,对K+通透 ,兴奋对 Na+ 通透超过 K+,通透性变化说明了神 经的电兴奋,产生了离子学说(钠学说)。 Eccles u1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次 在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时,记录到乙酰胆碱 (Acetylcholine, ACh)激活的单通道离子电流,从而产生了 膜片钳技术(patch clamp technique); u1980年Sigworth等获得10-100GΩ的高阻封接(Gigaseal) ,1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进,引进了全细 胞记录技术,从而使该技术更趋完善; u1983年10月,《Single-Channel Recording》一书的问世, 奠定了膜片钳技术的里程碑。 Neher Sakmann (1944-) (1942-) (德国细胞生理学家) (德国细胞生理学家) 合作发明了膜片钳技术,并应用这一技术首次证实了细胞膜存 在离子通道。这一成果对于研究细胞功能的调控至关重要,可 揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的 发病机理,并提供治疗的新途径。 二人共获1991年诺贝尔奖。 内尔在实验室进行膜片箝研究工作 1983年10月第一版 《Single-Channel Recording》 封面 电生理获医学诺贝尔奖名单(截止到2002年) 第一节 常规心肌电生理研究技术 在常规心肌电生理研究中,主要是采用 玻璃微电极插入在体或离体心肌细胞内,记 录心肌细胞的跨膜电活动,并研究各种因素 对其电活动的影响。 一、常用电生理仪器 v 刺激系统(刺激器等) v 检测系统(电极、换能器) v 放大系统(前置、后置放大器) v 记录显示系统(示波器、记录仪、 计算机) 1.电子刺激器(Electronic stimulator) 电刺激不易损伤组织,又能定量而准确 地重复使用。方波(矩形波,square wave )的幅度、波宽和频率都可分别进行调节, 所以矩形波电子刺激器可作为理想的刺激源 。 SEN-7203 方波刺激脉冲的参数要求: (1) 幅度(强度,amplitude) 矩形脉冲电压的最大瞬时值 (2) 波宽(刺激持续时间 time) (3)频率(frequency) 一个脉冲循环所需的时间为周期,周 期 的倒数(即1S内所含的周期数目) 称为频率 (4)延迟(Delay) 从触发脉冲到刺激方波的出现,这 一段时间称为延迟。 (5)刺激方式(Pattern of stimulation ) 单刺激、连续刺激、双脉冲刺激 (6)同步输出(Synchronized output) 同步脉冲表示一次刺激的时间起点 (7)刺激隔离器(Isolator) 当对实验动物同时进行刺激和记录生物电时 ,刺激器输出和放大器输入具有公共接地线,使 得一部分刺激电流流入放大器的输入端,使记录 器记录到一个刺激电流产生的波形,即刺激伪迹 。隔离器切断了刺激电流从公共地线返回的可能 ,减小伪迹并与电位分开。同时,消除50周交流 电感应造成的干扰。 2.微电极放大器(microelectrode amplifier) 组成:精密稳压电源、高输入阻抗探 头、主放大器、电容补偿电路、校正电 路、低通滤波电路等 Axopatch 200B (AXON,USA) Fast magnitude , Fast time constant(τ) 钮 Slow magnitude , Slow time constant(τ)钮 WHOLE-CELL CAP钮 要求: (1)足够高的放大能力 (2)频率响应范围大 0—100Hz (3) 低噪声 50uV (4) 高的辨差比(共模抑制比)1000:1 (5) 高输入阻抗 1000MΩ (6)低频与高频滤波 低频滤波----用于变化速度快的生物电变化 高频滤波----用于减少噪声,提高信噪比 3 示波器(oscillograph) 要求: 高灵敏度 扫描速度快 频率高 类型:双线示波器 多线示波器 长余辉慢扫描示波器 记忆示波器 VC-11 4 贮存和分析电生理实验结果的仪器 (1) 示波照相机 (2) 磁带记录仪 (3) 电子计算机 A/D转换- -把生物电(模拟 )信号转换成 数字信号 D/A转换-- 把数字信号转换成模拟信号 二 细胞外记录(Extracellular recording) 细胞外记录是把电极安放在心肌表面或 附近引导心肌组织或细胞的电活动。 适应范围: (1)长时间的实验; (2)对清醒的、能自由活动的动物研究; (3)从不同组织部位作同时的多导记录; (4)研究非常小的细胞,数量多而难于 孤立起来,接触和穿刺都易于损伤等; (5)研究器官的总的活动。 电极: (1)玻璃微电极 (2)金属电极 (3)离子选择性电极 (4)单极电极 (5)多管电极 三 在体心脏电活动的细胞内记录 (intracellular recording in situ) 1 实验装置 2 包括浮置式玻璃微电极、微电 极推进器、微电极放大器、示波器、 照相装置、记录仪、计算机等 推进器 微放器示波器 监听器 照相机 记录仪计算机打印机 微电极 心脏 2 动物手术 3 电极制作要求 4 插入 5 应用范围 生理、药理、心肌缺血等 6 优点:在近于生理状态下实验,可观察整 体因素对心肌电活动的影响,可研究药物及 其代谢产物的作用过程,更有利于阐明各种 调节因素、致病因素或药物对心肌电生理特 性的影响机制 7 缺点:记录不持久,影响因素多 四 离体心肌电活动的细胞内记录 (intracellular recording in vitro) 1 实验装置 2 微电极、标准微电极、微推进器 3 浴槽与灌流装置 生理盐溶液、混合气体、摄氏 30—37度 4 刺激器 5 应用范围 6 优点 稳定、长时间记录,可任意改变溶液成分 7 观察指标 RP , APA, APD10, APD50, APD90, Vmax 第二节:电压钳制技术 (Voltage clamp technique) 利用微电极技术,虽然记录到细胞内的电 变化过程,但不能阐明这种变化的原因。要阐 明跨膜电变化机制,必需应用电压钳制技术。 这一技术首先是由Cole及其同事设计,在经 Hodgkin等人加以改进,用于神经电生理研究 ,弄清了神经纤维在兴奋时离子流的情况。 一、细胞膜的生物物理特性 (Biophysical properties of cell membrane) 细胞膜主要由脂质和蛋白质构成。以脂质双分 子层为支架,镶嵌着不同特性的蛋白质颗粒。细胞膜 的电紧张及其扩布规律,膜的极化状态及其形成过程 中等都是细胞膜电缆性质(cable properties)的反映 。(轴浆电阻与膜电阻、膜电容的组合,使电流对膜 电位的影响起着依距离而衰减以及在时间上的延缓作 用――神经的“电缆”性质)。细胞膜的电缆特性从 定的等效电路及其时间常数和空间常数得到证实。 (一) 细胞膜的等效电路 从电学特点上分析,细胞膜可等效地模拟为电阻 -电容器。它具备细胞浆电阻(纵向电阻,Ri), 膜电阻(横向电阻,Rm),膜电容(Cm)和膜电 位(Em)四方面的电学特性,根据这四方面特性即可 构成其等效电路(Equivalent Circuit)。 outside Ri inside 膜电位等效电路的简化图 Cm 膜电容 Rm 膜电阻 Em 离子平衡电位 Ro 细胞外液的纵向电阻(Ω/cm ) Ri 轴浆的纵向电阻(Ω/cm) Ro CmRm Em + - 细胞膜的等效电路是一个并联的阻容 路,膜活动时既有电压的改变,同时又有 电流的改变。电位的改变可引起电容器的 充、放电,也可用于电阻器上的电流流动 。通过电容器的电流为Ic ,通过电阻的 电流为Ir。 1 纵向电阻(Ro、Ri) 由胞浆的性质所决定,具有较高的电阻率 ,它与直径是反比关系(直径大、电阻小, 直径小,电阻大)。由于它的存在,使生物 电的传导主要沿细胞膜所包围的容积导体进 行。它是单位长度的电阻,单位是Ω/cm , 细胞外间质的容积很大,其单位长度电阻( Ro)较Ri小。 2.横向电阻(redial resistance) 即细胞膜本身具有的膜电阻。细胞膜 由双层磷脂构成,厚度很薄,但具有很高 的电阻,即绝缘性。 膜电阻表示离子通过膜的有限能力。 膜 电阻反映了离子是否容易通透膜的情况。 膜电阻(Rm)的大小反映了膜结构电学方 面的差异。 膜电位、膜电流和膜电阻的关系遵循欧姆定律 Em = Im * Rm I = V / R(欧姆定律),膜电阻越大,对电流 的导通能力越小。 膜电阻的倒数膜电导(condactance,gm。 R=1/G)。g = I / V 或 I = g V 膜电位恒定情况下,电导与电流成正比,膜电悼越 大,膜电流也就越大。 不同的离子有不同的膜电导。同一种离子 ,其电导也是可变的。 细胞膜环境、生理状态、代谢水平、膜功能 状态的变动,膜电阻(Rm)将发生改变。 电导的单位是Siemens,S,mho 3.膜电容(capacity) 表示膜的绝缘及储存电荷的性质。任何一 种装置使两个导体中间插入一个绝缘体并安排 在一起,称为电容器。细胞外液及细胞内液均 为含电解质的溶液,可看作为两个导体;细胞 膜是含脂质的膜,可视作为绝缘体。细胞外液 -细胞膜-细胞内液三者组成了电容。 4 膜电位 (membrane potential) 当膜上离子通道开放而引起带电离子跨膜流动时 ,就相当于在电容器上充电或放电而产生电位差,即 跨膜电位。膜电位的高低决定于跨膜电化学梯度。 在两侧离子浓度不变的情况下,膜电位取决于膜电 导的改变(离子通透性的改变)。膜电导的大小又受 到膜电位的控制(离子通道的电压依赖性)。 5 膜电流(membrane current) 任何电流都是电容电流(Ic)和电阻 电流(Ii)两种形式通过细胞膜,前者导 致膜电荷的改变,后者实际上是由离子携 带流经细胞膜的。 I m = Ic + Ii (二) 细胞膜的时间常数(time constant) 时间常数是指膜电压随时间而改变的过程,用一 常数表示之。它反映膜电位在细胞膜上随时间而改变 的(缓慢)程度。也就是膜电位通过膜电阻和膜电容 充电到63%或放电到37 %所需的时间。 τ = Rm × Cm τ = 膜的时间常数 (ms);Rm=膜电阻(kΩ) Cm=膜电容(μF) (三) 细胞膜的空间常数(space constant) 空间常数,是度量电压的空间衰减,即标志 电压依距离而衰减的程度的一个常数。即: 膜电位通过膜电阻和纵向电阻所组成的分流 电路随距离的增大而按指数曲线规律衰减的 速度.或表示膜电位按指数曲线规律衰减到 37%所需要的距离。
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