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分子生物学技术2

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分子生物学技术 分子生物学2 2分子生物学分子生物学
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基因文库基因文库 基因文库(基因文库(gene librarygene library)) 基因组文库(基因组文库(genomic librarygenomic library)) cDNAcDNA文库文库((cDNAcDNA library library)) 应掌握的内容 • 基因文库的概念及构建基因文库的基 本程序 • 基因组文库的概念及操作步骤 • cDNA文库的概念及操作步骤 • 基因组DNA文库与cDNA文库的优缺 点 绝大多数基因难以直接分离得到 • 高等真核生物,基因组DNA十分庞大 • 基因可达数万个 • 基因组成结构复杂 编码序列 非编码序列 调控序列 间隔序列 重复序列 • 单个目的基因在整个基因组中所占比例极小 未知基因更难克隆 • 要分离的目的基因往往是未知基因 • 无法对它进行特异性扩增, • 只能对所有的基因进行扩增, 构建基因文库 • 然后再根据不同的方法将所需的克隆筛 选出来 • 最后分离得到目的基因。 基因文库(gene library) • 又称DNA文库,是指某个生物的基因 组DNA或cDNA片段与适当的载体在体 外重组后,转化宿主细胞,并通过一定 的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落 (或噬菌体),所有菌落(或噬菌体) 的集合即为该生物的基因文库。 • 基因文库由外源DNA片段、载体和宿 主组成。 基因文库包括基因组DNA文库和cDNA文库 Ø cDNA文库(cDNA library):以mRNA为模板,利用 反转录酶合成与mRNA互补的DNA,再复制成双链 cDNA片段,与适当载体连接后转入受体菌,这些受 体菌包含了所有cDNA信息,总称cDNA文库。常用于 筛选编码蛋白质的结构基因。 Ø 基因组DNA文库(genomic DNA library):利用限制 性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后,与适 当载体连接后转入受体菌,这些受体菌包含了所有基 因组DNA信息,总称基因组DNA文库 从特定组织提取的染色体基因组DNA,其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因,研究基因组成 从特定组织mRNA反转录成的cDNA拷贝,其目的是分离某一特定器官在特定发育时期细胞内的mRNA,研究基因表达 DNA文库构建的程序 载体 质粒噬菌体病毒 目的DNA(外源基因) 基因组DNA cDNA 人工合成PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的DNA 连接酶 重组体 转化体外包装,转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交 转化子 一、基因组DNA文库的类型 质粒文库 噬菌体文库 粘粒文库 人工染色体文库(细菌人工染色体文库 、酵母人工染色体文库) Vector Maximum Insert size Approx. No. of clones required in library AdvantagesDisadvantages lambda20 kb5 x 105easy hard to prepare DNA from clones cosmid45 kb2 x 105 easy to construct easy to prepare DNA from clones not always stable YAC1 Mb104few clones required very prone to rearrangement, difficult to construct PAC~120 kb105 fewer clones required than for cosmids stable single copy origin of replication therefore harder to prepare DNA BAC 500 kb5 x 104 few clones required very stable single copy origin of replication therefore harder to prepare DNA 二、基因组DNA文库的质量标准 一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件: •重组克隆的总数不宜过大,以减轻筛选工作的压力 •载体的装载量最好大于基因的长度,避免基因被分隔 克隆 •克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域,以利 克隆排序 •克隆片段易于从载体分子上完整卸载 •重组克隆能稳定保存、扩增、筛选等后续操作 三、基因组DNA文库构建的程序 ①载体DNA的制备; ②高纯度大相对分子质量基因组DNA 的提取和大片段的制备; ③高纯度大相对分子质量基因组DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离; ④载体与外源片段的连接与转化或 侵染宿主细胞; ⑤重组克隆的挑选和保存。 1、利用质粒载体 构建基因组文库 该法简单、快速、易 于操作,但仅适合一 些低等真核生物和原 核生物。 BamHI MboI OH POH HO 脱磷酸化 重组DNA T4 连接酶 转化E coli 基因组文库 总DNA HindIII BamHI SalI EcoRI PstI ScaI Tc Amp R pBR322 (4.36 kb) Ori HindIIIEcoRI PstI ScaI R Amp R Ori SalI 挑单克隆 2、利用噬菌体 构建基因组文库 cos序列是lamda噬菌体 DNA中将DNA包装到噬菌 体颗粒中所需的DNA序列 page171 page171 四、原核生物基因组DNA文库的构建 (一)原核生物基因组DNA的提取 染色体DNA 质粒DNA 要求:制备的DNA的长度为100-200kb, 防止在制备过程中的机械断裂 (二)基因组DNA的不完全酶切 1、根据实验需要选择合适的限制性内切酶 a) 四个识别位点的限制酶出现的几率: 1/256 b) 六个识别位点的限制酶出现的几率: 1/1024 2、分离目的酶切片段大小的确定 a) 克隆单个基因: 10 kb b) 克隆基因族: 20kb 3、DNA不完全酶切条件的确定 a) 确定限制酶用量,改变酶切时间 b) 固定酶切时间,改变限制酶的用量 不完全酶切 完全酶切 (三)酶切片段与克隆载体连接 1、酶切片段的分离与纯化 1)低熔点琼脂糖回收目的片段 2)试剂盒回收目的片段 多糖链上引 入羟乙基后 的琼脂糖。 由于其能在 30℃左右成 胶,约65℃ 熔化,熔化 温度低于大 多数双链 DNA熔点。 利用低熔点 琼脂糖的这 种性质可以 从凝胶中回 收天然形式 的DNA。 2、酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择 a)质粒载体可承载15kb DNA左右片段 (有效 的范围为10kb) b)载体可承载25kb DNA左右片段(有效的 范围为15 kb) c)Cosmid 载体可承载45kb DNA左右片段( 有效的范围为40 kb) (四)重组DNA转化受体细胞 1、根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞 常见的宿主细胞: DH5: 用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷 型的抑制型菌株,可与pUC编码的-半乳糖苷酶氨 基端实现互补。 HB101: 用于大规模制备质粒的抑制型菌株,转化效率高 JM101: 可支持带有琥珀突变载体生长的宿主菌 JM109: 支持带有琥珀突变载体生长的重组缺陷的抑制型菌 MZ-1: 温度敏感的溶源性菌株,用于含有噬菌体PL启动子 质粒载体的宿主菌 2、重组质粒转化受体细胞 1)转化法(transformation) 某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基 因型的细胞的 DNA而使它的基因型和表型发生相 应变化的现象;一种生物吸收另一种生物的遗传物 质从而转变后者遗传性状的现象。在基因克隆技 术中,将质粒DNA及其重组体导入细菌,称为转化 2)转导法(transduction) 噬菌体及其重组体导入受体细胞称为转导 3)转染法(transfection) 病毒及其重组体导入受体细胞,称为转染 • 表型筛选法:表达性状易于鉴别,如互补 筛选 • 抗性筛选法:如二氢叶酸还原酶可以使三 甲苄 二氨嘧啶降解,而该化学物可抑制大肠 杆菌生长 • 分子杂交法:利用分子探针对文库进行筛 选 • 免疫筛选法:利用多肽等作为抗原进行原 位杂交筛选 • PCR筛选法:根据保守序列合成引物,扩增 特异性片段 五、基因组DNA文库的筛选 • 高等生物一般具有105种左右不同的基因,但 在一定时间阶段的单个细胞或个体中,都仅有 15%左右的基因得以表达,产生约15000种不同 的mRNA分子。可见,由mRNA出发的cDNA克 隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多 。 RNA操作与 cDNA文库构建 一、一、RNARNA提取提取 • • RNARNA的不稳定性的不稳定性 Ø由于核糖残基的2’和3’位置带有羟基, RNA易于被RNA酶切割水解 Ø RNA酶含量丰富,加热后仍能够正确折 叠恢复活性,不易失活 提取提取RNARNA的注意事项的注意事项 Ø 经常更换新手套。因为皮肤和实验室用品上 可能有RNase,会导致RNase污染。 Ø 使用灭过菌的塑料制品和枪头避免交叉污染 。 Ø 应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃 器皿可在150℃烘烤4小时,塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟,然后用水彻底清洗,再 灭菌,即可去除RNase。 常用常用RNARNA酶抑制剂酶抑制剂 Ø 焦磷酸二乙酯(DEPC): 与RNA酶的活性基团组氨酸 的咪唑环结合使蛋白质变性,强烈但不彻底的RNA酶抑制 剂 。 Ø 异硫氰酸胍:目前是最有效的RNA酶抑制剂,裂解组织 的同时也使RNA酶失活。既可破坏细胞结构使核酸从核蛋 白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。 Ø 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合 物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制 RNA酶的活性。 Ø 其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作 用。 RNARNA提取的步骤提取的步骤 材料的准备和裂解 杂质的去除 RNA的吸附或沉淀 异硫氰酸胍,亚硫氢胍,巯基乙醇, N-月桂肌氨酸 等。使细胞及核蛋白复 合物变性,释放RNA,有效抑制核酸 酶。 苯酚,氯仿,异戊醇抽提去除杂物, 使DNA及蛋白沉淀到有机相。 硅质材料的吸附 或用异丙醇沉淀浓缩RNA。 经DEPC 处理的水溶解RNA RNARNA的检测的检测 Ø电泳槽系统的处理 Ø含有甲醛的琼脂糖凝胶电泳 ØRNA纯度及浓度的检测 (A260=1 ,约40 μg/ mL RNA; A260/A280 约为1.9-2.1 ) 1 抽提过程不彻底存 在蛋白或多糖多酚 的污染 2 DNA 的污染 3 离子浓度较高 原因 对 策 1 保证彻底的裂解和一定 转数一定时间的离心; 增加有机溶剂抽提的次 数,用吸附柱纯化 2 减少处理样品的量;加 入不含RNase的DNase处 理;再次纯化 3 增加漂洗次数 RNA提取常见问题 q问题一: RNA样品不纯 1 样品含有杂质杂液 2 样品过量或样品裂解 和匀浆不彻底 3 RNA未有效的吸附沉 淀或洗脱 4 样品RNA含量少 原因 对 策 1 去除样品中的杂质,离 心除净样品中的培养基 或储存液 2 减少样品用量;充分研 磨样品,增加裂解液的 用量和裂解的时间 3 延长吸附时间或保证异 丙醇沉淀的时间和离心 时间;再次洗脱 4 重复吸附,加入肝糖等 有助RNA沉淀的试剂 q问题二: RNA得率低 1 样品不新鲜或样品 保存不当,RNA降解 2 污染了RNase 3 样品储存不当 原因 对 策 1 尽量取新鲜的样品;取样 后立即放入液氮保存;或 放入专门的储存液内;研 磨样品及时补充液氮 2 认真地处理相应的器具和 试剂;严格地操作 3 -70℃ 冻存,分装使用; 加入RNase抑制剂 q问题三:RNA容易降解 二、二、 cDNAcDNA基因文库构建基因文库构建 (一)cDNA文库的特点 • 有基因特异性 • 有器官特异性 • 代谢或发育特异性 • 不均匀性 (二)cDNA基因文库构建的步骤 • 细胞总RNA的提取 • mRNA的分离和纯化 • 第一条cDNA合成 • 第二条cDNA合成 • 双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体 • 导入宿主中繁殖 page173 mRNA的纤维素柱吸附分离纯化 Promega 公司的试剂盒就采用此原理 2、mRNA的分离纯化 • 方法一:oligo(dT)引导第一链合成: • 利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾 巴的特性,加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核 苷组成的oligo(dT)短片段,由反转录 酶合成cDNA的第一链。 • 缺陷:因为反转录酶无法到达mRNA分 子的5’-末端,必须从3’-末端开始合成 cDNA。对于大分子量的较长的mRNA分 子而言,特别麻烦。 3、第一链cDNA的合成 Oligo(dT)引导的DNA合成法 • 方法二:随机引物引导第一链合成 (randomly primed cDNA synthesis) : • 根据许多可能的序列,合成出6-10个核 苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作 为合成第一链cDNA的引物。在应用这种 混合引物的情况下,cDNA的合成可以从 mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅 仅从3’-末端的oligo(dT)引物一处开始 。 • cDNA第二链的合成就是将上一步形成 的mRNA-cDNA杂合双链变成互补双链 cDNA的过程。 • cDNA第二链的合成的方法大致4种: 1 自身引导法 2 置换法 3 引导合成法 4 引物-衔接头合成法。 4、第二链cDNA的合成 1)自身引导法: • 首先用氢氧化钠消化杂合双链中的mRNA 链,解离的第一链cDNA的3‘-末端就会形 成一个发夹环(发夹环的产生是第一链 cDNA合成时的特性,原因至今未知,据推 测可能是由帽子的特殊结构相关) • 这个发夹结构可以作为引物引导DNA聚合 酶复制出第二链,此时形成的双链之间是 连接在一起的,再利用S1核酸酶将连接处 切开(仅该位点处为单链结构,切断形成 平端结构,可以进行后续连接反应) 。 缺点: 在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于mRNA 5’端的地方的序列出现缺失和重排。 S1核酸酶的纯度不够时,会偶尔破 坏合成的双链cDNA分子。 2)置换法合成cDNA第二链: RNA引物 缺口缺口 RNaseH切割mRNA形成引物,在DNA聚合酶作用下 优点:合成cDNA的效率高;直接利用第一链的反应产物,不需纯化;避免 使用S1核酸酶来切割双链cDNA 缺点:获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺失 3)引导法合成cDNA第二链 • 又称为 第一链3’端加尾法 • 本方法是 Okayama 和 Berg 1982 提出的。 • 在第一链 cDNA 合成后直接采用末端转移酶 在其 3‘-端加上一段 Poly(dC)的尾巴,DNA 聚合酶 I利用载体上 Poly(dG)为引物进行第二 链的合成 • 其优点在于:获得的双链cDNA 能保留完 整的5’端序列 •但操作比较复杂,形成的 cDNA 克隆中都带有一段 Poly(dC)/(dA),对重组子的复制和测序都不利 4)引物/接头法 合成 cDNA第二链 • Gubler 和 Hoffman(1983)通过改进 引导合成法而来 • 第一链合成后直接采用末端转移酶在第 一链 cDNA 的 3'-端加上一段 Poly(dC) 的尾巴,然后用一段带接头序列的 Poly( dG)短核苷酸链作引物合成互补的 cDNA 链,接头序列可以是适用于 PCR 扩增的 特异序列或用于方便克隆的酶切位点的序 列。这一方法目前已经发展成 PCR 法构 建 cDNA 文库的常用方法 引物/接头法 图示 AAAAAAA TTTTTTTTCAGCTGAGG RNaseH水解RNA 末端转移酶在第一链3’端加polyC 与polyA对应的单链接头-引物 引导cDNA第一链合成 mRNA 5’帽子结构 cDNA第一链 3‘CCCCCCC polyG引导第二链的合成,并加入 含有下一步克隆所需要的限制酶切 位点的linker (A)nGTCGACTCC3’ (T)nCAGCTGAGG5’ TTTTTTTTCAGCTGAGG 5’GGAGTCGAC(G)n 3’CCTCAGCTG(C)n linker (A)nGTCGACTCC3’ (T)nCAGCTGAGG5’ 5’GGAGTCGAC(G)n 3’CCTCAGCTG(C)n Sal I Sal I (A)nG3’ (T)nCAGCT5’ 5’ TCGAC(G)n 3’ TG(C)n 这就便于克隆了 • cDNA末端的处理 –由于大片段的平末端连接效率非 常低,因此为了避免用平末端与载体连 接,对双链cDNA的末端进行加工是十分 必要的 –方法:添加特异性核酸接头以形 成适合于克隆的粘性末端 –末端转移酶—可以向cDNA末端 加上与克隆载体末端互补的尾部 5、双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载 体并导入宿主中繁殖 AAAAACCCCCC TTTTT AAAAA TTTTT CCCCCC CTGCA G G ACGTC PstI pUC18pUC18 dGTP CTGCAGGGGGG G GGGGGACGTC CTGCAGGGGGG G GGGGGACGTC CCCCCC AAAAACCCCCC TTTTT GGGACGTC ACGCTGGGGGG CCCCCC cDNA 末端转移酶末端转移酶dCTP 连接 环化 补平 转化寄主 基因组DNA文库与cDNA文库的比较 基因组DNA文库的优点总结 相对于cDNA文库,基因组文库的优点: • cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结 构,没有包括基因组的间隔序列 • 从cDNA克隆中,不能克隆到基因组 DNA 中的非转录区段序列,不能用于研究 基因编码区外侧调控序列的结构与功能。 cDNA文库的主要优缺点 优点: • cDNA文库的筛选比较简单易行。 • 每一个cDNA文库都含有一种mRNA序列,这样在 目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低 ,因此阳性杂交信号一般都是有意义的,由此选 择出来的阳性克隆将会含有目的基因。 • cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的 克隆,直接应用于基因工程操作。 • cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能 研究。 • cDNA文库以mRNA为材料,特别适用于某些RNA 病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离 。 缺点: • cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组 DNA文库,并且受细胞来源或发育时期的影响。 • cDNA文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信息 ,但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区 外大量调控序列的结构与功能方面信息。 • 在cDNA文库中,不同克隆的分布状态总是反映 着mRNA的分布状态,相应于高丰度mRNA的cDNA克 隆所占的比例比较高,分离起来比较容易,而相 应于低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低 ,因此分离也就比较困难。
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