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第四节 超薄切片技术

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生物电子显微技术 第四章 超薄切片技术 生物电子显微技术 一、生物样品制备技术的重要性 二、TEM样品制备技术分类 四、超薄切片技术概述 第一节 基本概念 三、扫描电镜样品制备技术 生物电子显微技术 一、生物样品制备技术的重要性 1)电镜本身的分辨本领 2 )样品的结构和反差,而样品的结构与反差在很 大程度又取决于样品制备技术 1、决定电镜图像分辨率的两个因素 2、电镜样品应具备的基本条件 1)样品必须彻底干燥; 2)样品要进行提高反差处理 3)样品厚度要适宜 4)样品耐受电子束的轰击 5)充分保存好生物样品的超微结构 生物电子显微技术 二、TEM样品制备技术分类 1、超薄切片技术(普通) 2、冷冻超薄切片技术 3、冷冻置换和低温包埋技术 4、金属投影技术 5、表面复型技术 6、冷冻(断裂)蚀刻及复型技术 7、免疫电镜技术 8、电镜细胞化学技术 TEM,SEM共有 9、电镜放射自显影技术 生物电子显微技术 1、表面镀金(喷镀)技术 2、组织导电技术 3、冷冻断裂技术 4、离子蚀刻技术 5、临界点干燥技术 6、冷冻干燥技术 7、铸型观察技术(复型) 注: 最基本、最经典的还是超薄切片技术 SEM,TEM共有 三、扫描电镜样品制备技术 生物电子显微技术 四、超薄切片技术概述 1、超薄切片 ★样品厚度在10~100nm之间的切片为~ 石蜡切片h=10m(5~50m) 超薄切片TEM专用, 一般500~700Å 2、制作超薄切片的必要性 1). 增加电子透射能力 2). 电镜的场深大,切片太厚,上下结构重 叠,使得图像不清楚 3). 减少色差 4). 减少样品对电子的吸收 生物电子显微技术 ⑴ 细胞的细微结构保存良好,没有明显的物质凝聚 、丢失、添加等人工效应 ⑵ 切片厚度500~700Å为宜 ,小于1000 Å 太薄:高,反差低 太厚:低,反差好,结构重叠,电子甚至 不 能穿透 ⑶ 切片应耐电子束的强烈照射,不变形,升华 ⑷ 切片能够适当被染色,保证一定的反差 ⑸ 切片均匀,无皱褶、刀痕,无染色剂或其他 化学物质的沉淀 3、对超薄切片的要求 生物电子显微技术 取材→固定→脱水→渗透→包埋→聚合→修块→ 切片→染色 4、超薄切片制备的一般程序: 生物电子显微技术 第二节 普通超薄切片技术 一 取材 二 固定 三 脱水 四 渗透与包埋 五 超薄切片 六 电子染色 生物电子显微技术 操作规则:快,小, 冷,准,稳,轻(防损伤) ⑴ 快:动作迅速,快取,投入固定液 ⑵ 小:样品体积小,动1mm3,植宽1,长3~4 ⑶ 冷:0~4℃ ⑷ 准:取的部位准,有代表性、目的性 ⑸ 轻:操作轻巧,避免拉、锯、压 一、取材 1、含义 指从生物体上取下要观察的组织块。 2、取材操作规则 注意:由于水解酶的作用可引起细胞自溶 生物电子显微技术 ⑴动物材料 麻醉→解剖→ 戊二醛预固定( 0~4℃, 2%~5%) 在预冷的玻板上细切(1mm3) →戊二醛前固定 (1~3h) →漂洗(10~30min) → 1%锇酸后固定 (1~2h) ⑵植物材料 叶片宽1,长3~4,有时需脱蜡 根茎果实1mm3 ⑶单细胞:洗去有机成分→固定→预包埋→切块 3、取材方法 A、按样品类别分为: B、按取材地点分为: ⑴野外取材:冰壶 ⑵实验室室内取材 生物电子显微技术 1、概念:用化学或物理方法迅速将细胞、组织杀 死,同时把从细胞间的联系到细胞器的分子结构等 全部组织的活体形态、精细结构及其组成真实的保 存下来. 2、常用的固定方法 •化学方法:锇酸(OsO4), 戊二醛 (C5H8O2), 甲醛(HCHO),高锰酸钾KMnO4、 重铬酸钾、丙烯醛 •物理方法:冷冻,干燥,高温 二、固定 (一)固定的基本知识 生物电子显微技术 ⑴ 把细胞中的动态系统定格,要求生命过 程立即停止,细胞和它周围组织中的半液 体内含物立即凝固而不分解,接近细胞有 机体的生活状态 ⑵ 防止以后的制备过程中丢失或添加成分 ⑶ 使其在电镜下有良好的电子反差 3、固定的目的 生物电子显微技术 4、固定的标准 细胞内膜结构线条清晰连续不断,细胞基质 无明显溶泡和颗粒凝集 生物电子显微技术 1)组成: 固定液:固定剂+缓冲液 2)作用: ⑴ 破坏细胞的酶活性系统 ⑵ 稳定细胞物质成分,并保存之 ⑶ 接近细胞生活状态的渗透压,使细胞不收 缩或膨胀 ⑷ 在组分的分子之间建立交联,提供骨架稳 定细胞器的空间构型 ⑸ 提供一定的电子反差 5、固定液的作用 生物电子显微技术 1)渗透力强,穿透速度快,能迅速达到组织块的各 部位,立即杀死细胞,以尽量减小死后变化 2)稳定细胞成分和结构,使各种结构成分凝固或变 性,以保证后续的各种处理中物质不溶 解、不丢失 3)使细胞不变形,保持各种结构生活时形状,不产 生人工假象,以保证电镜图像的真实性。 4) 能保存一定的酶活性,以供细胞化学的测定 5) 最好提供一定的反差 ,并有防腐作用 (二)常用的固定剂 1、常用、理想固定剂应具备的条件 生物电子显微技术 优点: ⑴ 几乎和细胞内所有成分发生化学结合 ⑵ 对氮具有较强亲和力,对含有蛋白质的细胞结构固定作 用良好 ⑶ 可保存脂肪,形成脂肪-锇复合物 ⑷ Z=76,增加膜的反差 ⑸ 对磷脂蛋白、核蛋白保护很好 2、理想固定剂 1)锇酸(OsO4) 生物电子显微技术 锇酸缺点: ⑴ 不能固定糖元、碳水化合物、核酸 ,对微管固定效果差 ⑵ 酶的钝化剂,不能用于细胞化学研 究 ⑶ 分子量大,渗透能力差,要求组织块 小 ⑷ 固定时间不宜过长 ⑸ 可与乙醇、醛类氧化还原反应生成 沉积 ⑹ 有挥发性、剧毒 生物电子显微技术 2)戊二醛( C5H8O2) 优点: ⑴ 固定迅速,样品块可以大于1mm3 ⑵ 能保存糖元、蛋白质、核蛋白,核酸,尤其对微 管,内质网等固定效果最好,对细胞内结构有较 强的亲和力 ⑶ 可长时间固定(7天),适于野外取材 ⑷ 不易使酶失活,适于细胞化学研究 ⑸ 不挥发,但容易经皮肤吸收,对呼吸道粘膜有 刺激性 生物电子显微技术 戊二醛缺点: ⑴ 不保存脂肪 ⑵ 无电子染色作用 ⑶ 对缓冲液的要求严格 很差 很好 糖元 良好很好好锇酸 很差很好尚好戊二醛 脂类核蛋白蛋白质固定剂 不强有小很差 强无大较好 对 BS的选择性电子染色 渗透核酸 四氧化锇与戊二醛的固定作用比较 锇酸 戊二醛 固定剂 生物电子显微技术 双固定法:指用戊二醛对样品前固定,漂洗 后使用锇酸对样品进行后固定,这种使用两 种化学试剂分别前后对样品进行固定的方法 称为双固定法。 3) 甲醛(HCHO) :甲醛+戊二醛 滲透速度快、固定迅速,对酶活 性的保护优于 戊二醛,经济方便 4) 高锰酸钾(KMnO4) 磷脂蛋白,对神经髓脂质很好,细胞膜性结 构、叶绿素固定良好。 生物电子显微技术 1、缓冲液:一种仿效细胞外液成分 ,对细胞富有生理保护功能的溶液 2、缓冲液主要作用 ⑴ 维持稳定的pH值 ⑵ 提供适当的渗透压 ⑶ 提供适当的离子成分使样品不抽提 ,不沉淀 3、附加剂: »调节渗透压,NaCL, CaCL2,蔗 糖,葡萄糖 (三)缓冲液和附加剂 生物电子显微技术 储备A液(0.2M):磷酸氢二钠 (Na2HPO4.2H2O)35.61g加水定容1000ml 储备B液(0.2M):磷酸二氢钠 (NaH2PO4.2H2O)27.6g加水定容1000ml 0.1M磷酸缓冲液(PBS),由储备A液(0.2M)和储备B液 (0.2M)按上表比例合成,然后稀释定容到100ml。 优点:对细胞无毒害,便宜,易于大量配置 缺点:易产生沉淀,不稳定,易受到细菌污染 pH(25。 C) 6.26.66.87.07.27.47.6 A液9.2518.7 5 24. 5 30.5 36.0 40.543.5 B液40.7 5 31.2 5 25. 5 19.514.09.56.5 ⑴.磷酸盐缓冲液4、常用缓冲液 生物电子显微技术 ⑵.巴比妥盐 对锇酸适用,戊二醛不能,不长期保存 ⑶.二钾胂酸盐 可长期保存,有毒,有臭味 (四)、固定 1、固定液的配制 生物电子显微技术 ⑴单固定: 戊二醛或锇酸单次固定1~3小时 ⑵双固定: 前固定(戊),漂洗,后固定(锇) ⑶多重固定: 用三种以上的固定剂对样品进行固定 2、固定的方法 1)按固定液的成分划分为: 2)按固定方式分为: a. 浸泡固定 b. 体外固定 c. 原位固定 d. 灌流固定 生物电子显微技术 固定操作示意图 生物电子显微技术 漂洗操作方法 生物电子显微技术 1) 固定液的浓度:戊二醛1-5%,锇酸1-3% 浓度低→固定时间长→细胞质的抽提,组织肿胀 浓度高→易损细胞微结构,OsO4或KMnO4可使蛋 白质分子氧化而断裂 2) 固定液的渗透压: 渗透压低→细胞器或整个细胞膨胀 渗透压高→细胞收缩 3) pH值:植物6.8~7.1,动7.2~7.4 4) 固定的温度:0~4℃ 但低温对细胞微丝、微管有害 5) 组织块的大小:0.5~1mm3 6) 固定液的用量,一般为组织块的500倍 3、固定注意事项: 生物电子显微技术三 脱水(dehydrate) 1. 定义: 用适当的有机溶剂取代组织和细胞中的 游离态水分的过程。 2. 脱水的原因: ⑴包埋时一般使用非水溶性包埋剂,为了更好的包埋样 品,提高包埋质量必须对样品脱水; ⑵湿样品反差低、必须干 燥; ⑶含水样品在高真空下容易被破坏。 3. 脱水的原则:逐级梯度脱水(80%及以前4℃) 30%→50%→70%→80%→90%→95%(每次5 ~15min)→100%(2~3次,每次15min)→100%环 氧丙烷(乙醇脱水时必须的一步骤,15min) 生物电子显微技术 4. 常用的脱水剂: 乙醇、丙酮、甲醇、乙二醇、聚乙二醇、 环氧丙烷、包埋剂的单体。 5. 脱水注意事项: ⑴ 脱水要彻底 ⑵ 更换液体动作要迅速 ⑶ 脱水时间不宜过长 ⑷ 固定后的 样品要充分漂洗 生物电子显微技术 附加步骤:块染(Block Staining) 块染:在脱水前或脱水时对组织块进行的染色 叫块染。(在切成片之后的染色可称为“片染”) 脱水前染色: 双固定→ 漂洗→ 0.5%~4%的醋酸双氧铀 染色,1h,4℃→脱水 脱水时染色: 脱水至70%乙醇→ 硝酸铅的70%乙醇饱和溶 液中2h,4℃→ 70%乙醇漂洗→ 继续脱水 生物电子显微技术 四 渗透与包埋 目的:使包埋剂逐步渗透到组织细胞内部,以便与 细胞外的包埋剂同时聚合,以保证切出优质 的超薄切片。 步骤:渗透,包埋,聚合 (一)、渗透(Infiltrate) 渗透:用另一种溶液或混合液逐渐取代组织内的脱 水剂(或前介质),使细胞内外所有的空隙 被渗透液填充。 脱水剂的比例↘包埋剂↗→纯包埋剂 脱水剂:包埋剂=3:1 → 1:1 → 1:3 →纯包埋剂 生物电子显微技术 渗透时间表(小时) 脱水剂:包埋剂 动物材料植物材料 体外培养细胞 3:1110.5 1:11~41~120.5~1 1:31~22~120.5 包埋:将渗透好的样品块放入到适当的包埋 模具中,灌装上纯包埋剂包埋,经加温聚合 形成一种固体基质,牢固地支撑整个细胞结 构或组织,同时又不混乱其空间联系,制成 适于机械切割的固体包埋块。 (二)、包埋(embedding) 生物电子显微技术 1、包埋剂应具备的条件: ⑴ 聚合有良好的切割性能,软硬度易调节 ⑵ 粘度低,易渗透 ⑶ 溶于脱水剂 ⑷ 电子透明度好,并具有一定的反差 ⑸ 聚合要充分、均匀,聚合温度要尽可能低 ⑹ 本身无结构 ⑺ 热稳定性好,可耐电子束轰击 ⑻ 来源丰富,且各批号性能尽可能一致 ⑼ 切片易染色,且对人体无害 生物电子显微技术 2、常用包埋剂 1) 甲基丙烯酸酯 优点:分子量小,粘度低,易渗透;,硬度易 调节,切割性能好;电子透明度高,电子反差 好;无毒性,便宜 缺点:聚合需要一定条件;聚合后体积变 化大,聚合损伤大;不稳定,不耐电子束轰击 易升华或蒸发 2) 聚酯树脂 优点:对样品损伤小,耐电子束的轰击,聚 合收缩小,适合于细菌和植物组织等硬样品, 缺点:不稳定,易脆裂 生物电子显微技术 3)水溶性包埋剂 常用试剂:乙二醇甲基丙烯酸酯(GMA),聚乙二醇 (PEG),甲基丙烯酸羟酸酯(HPMA) 注意:GMA需低温包埋,聚合时GMA和HPMA需 紫外照射 应用:适于电镜细胞化学和组织化学研究 4) 环氧树脂类包埋剂: 特点:聚合收缩率低,均匀,对样品损伤小,耐轰 击,但切片困难,染色后反差小,有刺激作用 常用试剂:Epon-812 ,国产618,ERL-4206 Epon-812:甘油多聚酯,低粘度,易渗透 加速剂:DMP-30(2,4,6-三(二甲基氨 基甲基苯酚) 固化剂:DDSA(十二烷基琥珀酸酐),块软 MNA(六甲酸酐) ,块硬 生物电子显微技术 3. 常用配方: ⑴ Epon-812配方(1961,Luft) A液: Epon-812 5ml DDSA 8ml B液: Epon-812 5ml MNA 7ml 最终: A液13, B液15, DMP-30 16滴(1~2%) 夏天:A:B=2:8(A多软) 冬天:A:B=1:9(B多硬) 生物电子显微技术 生物电子显微技术 (2) 国产618配方: 618 12ml +DDSA 8ml +DBP(增塑剂,苯二 甲酸二酯丁)0.6~1.6ml +DMP-30 0.2~0.4ml (1~3滴) (3) ERL-4206:低粘度,易渗透 4, 包埋方法: – 常规包埋: – 定向包埋: 浅槽包埋、二次包埋、加条包埋 生物电子显微技术 生物电子显微技术 (三)、聚合 37℃(12h)→45 ℃(12~48h) →60 ℃(24~48h) (四)、注意事项 1、一切器材均须烘干 2、配制包埋剂时,逐项加入试剂并搅拌 3、做好的包埋块置于干燥器中 4、配制包埋剂不宜长时间存放,室温下 也有一定程度聚合 生物电子显微技术 渗透、包埋、聚合操作图 生物电子显微技术 生物电子显微技术 五 超薄切片 A. 载网: 1、作用: 承载样品,以便后续染色和观察 2、分类 从材料:铜,镍,钼,金,银,铂,不锈钢, 尼龙,碳 形状上分:圆型,蜂窝,正方形,长方形 单孔型,狭逢型 大小:d=2~3mm,h=0.1mm 目:一英寸的线段上具有的孔的数目 常用180~230目(让70%电子束通过) (一)、载网和支持膜 生物电子显微技术 3、载网的特点 大孔径(目数少):电子透过率高,支持性差, 在低倍、分辨率低、大视野 场合下使用 小孔径(目数多):反之 4、载网的清洗: 目的:清洁,除去静电 新网:丙酮或乙醇浸洗,双水洗 旧网:溶膜→酸碱,超声,离子蚀刻 生物电子显微技术 点击返回 生物电子显微技术 生物电子显微技术 B. 支持膜的制备 1、特点: ① 本身无结构 ② 电子透明度高 ③ 机械强度高,耐电子束的轰击,稳定性好 ④ 不与样品发生反应 ⑤ 厚度适中,150Å 2、常用支持膜 ① 福尔莫瓦膜(Formvar): 聚乙烯醇缩甲醛,0.2%~0.5%氯仿溶液, 机械强度高,制作简易 ② 火棉胶膜:强度低,制作简易,1~2% 醋酸异戊酯溶液 生物电子显微技术 ③ 帕罗丁膜:30%醋酸戊酯溶液,强度稍 高于火棉胶膜 ④ 碳膜:机械轻度高,化学稳定好。适于 高分辨率样品,需专用仪器: 真空喷镀仪 ⑤ 复合膜:有机膜+碳膜(50~100Å) ⑥ 微孔支持膜(微筛):高分辨率用 哈气法、甘油法、气压法 生物电子显微技术 返回 生物电子显微技术 返回 生物电子显微技术 返回 生物电子显微技术 返回 生物电子显微技术 (二)、制刀 1、刀的种类: 玻璃刀,钻石刀 2、玻璃刀的制作: ①玻璃要求:硬,含硅高(72~75%), h=4~8mm,宽25mm、38mm,长30cm ②步骤: »洗涤玻璃条,并晾干 »制成小方块,对角折断 »检查刀刃 生物电子显微技术 ③ 检查的标准: »中左端平直无缺损 »右端稍上翘 »显微镜下刀刃有明亮的应力线 ④ 制刀的手段 »手工制刀, »专用制刀机制刀(LKB7800) 生物电子显微技术 生物电子显微技术 钻石刀 生物电子显微技术 (三) 装水槽 1. 方法: ⑴ 装塑料模具水槽 ⑵ 自制胶带水槽 2. 槽液的要求 ⑴ 不与材料发生化学反应 ⑵ 干净无杂质 ⑶ 液面与刀口基本平行 ⑷ 低粘度,蒸发量小 ⑸ 有一定的表面张力,有利于漂浮切片 3.常用的槽液: 双蒸水、二甲基亚砜(DMSO)、 甘油水溶液等 生物电子显微技术 生物电子显微技术 玻 璃 刀 口 的 选 择 生物电子显微技术 玻璃刀、载网、包埋块及塑料模具水槽 生物电子显微技术 (四)修块 1.目的 ⑴ 除去组织周围多余的包埋介质和 不感 兴趣的部分,以提供较大的有效观察面积 ⑵ 含组织块的区域和不含组织块的区域硬度 不同,经过修块,尽可能除去组织块外的 空白包埋介质,使要切的部分硬度一致, 切出高质量的切片 ⑶ 修成一定形状、大小的包埋块截面,便于 连续切片 生物电子显微技术 2. 修块的方法 ⑴ 手工修块: 粗修:四棱台型 细修:小四棱台塔型或二层四棱台型 (Mesa型),顶面积0.1mm2, 四个侧面要整齐、规则 ⑵ 机械修块: (专用修块机或超薄切片机) 先修顶面暴露样品 后修四个侧面 生物电子显微技术 生物电子显微技术 生物电子显微技术(五)、切片 1、超薄切片机 (Ultramicrotome) ⑴ 按进刀原理分为: 机械推进式:AO型 热膨胀式:I↗膨胀↗切片厚↗ LKB(Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ),CQR-1 冷缩式 ⑵ LKB切片机构造 ⑶ 切片的原理 加热线圈→金属臂膨胀→推进样品→ 电动机驱动样品臂上下运动→切削 2、切片操作步骤: 装块→装刀→对刀→加水→切片→捞片 生物电子显微技术 返回 生物电子显微技术 生物电子显微技术 生物电子显微技术 3、切片原则: 1)刀角、前角,切速参数的选择原则: ⑴ 软硬适中的包埋块,45刀角,3~5前角, 2~5mm/s ⑵ 包埋块硬,小刀角,切速小; 包埋块软,大刀角,切速大 ⑶ 较薄样品,切速大20mm/s 要获得较大面积的切片,切速1mm/s 生物电子显微技术 2) 预先制作半薄切片的原则: ⑴ 半薄切片的定义: 切片的厚度介于普通切片和超薄切片 之间的切片,0.5~2µm ⑵ 半薄切片的作用: 精确定位样品特征位置点, 并筛选包埋块 生物电子显微技术 返回 生物电子显微技术 4、切片厚度的判断 颜色厚度(Å) 切片 厚度 分辨 率 反差 暗灰色400Å太薄高小 铅灰色400~500较薄高小 银银灰或银银白500~700适中好好 米黄、金黄700~1000较厚低好 紫色(蓝)1000以上 不能 用 生物电子显微技术 生物电子显微技术 5、展片、捞片 6、超切注意事项 ⑴ 切片是否成功,对刀是关键 ⑵ 槽液用新鲜的重蒸水 ⑶ 切片时的温度20~25℃,相对湿度60%, 室内无空气流动,清洁,防止震动 ⑷ 不损坏封固刀槽的石蜡,否则漏水 7、切片缺陷产生的原因及排除方法 生物电子显微技术 生物电子显微技术 生物电子显微技术 生物电子显微技术 生物电子显微技术 六、电子染色 1. 电子染色(Electron Staining) 1) 概念: 利用高密度的重金属染色剂(铅、铀)与细 胞某些微细结构或成分结合,以增加样品局部的 电子散射能力,提高电镜图像反差的方法。 2) 原理: 结合重金属多的区域,△t大→电子散射 能力强→电子密度大→图像深暗 反之… 生物电子显微技术 2、常用染色剂(Pb,U盐) 1)铀盐:醋酸铀(醋酸双氧铀)UO2(CH2COO)22H2O 特点: A.可以和细胞中大多数成分结合,可以提高核 酸、蛋白质和结缔组织的反差,对膜的染色差 B.有放射性,发射荧光,有毒,见光分解 配方及染色 A. 常用1-5%的醋酸双氧铀,室温下染色 30min-1h;40-70℃用时20-30min. B. 1-2%醋酸双氧铀的50%,70%或95%的 乙醇溶液,穿透力强,20-30min. 生物电子显微技术 2)铅盐:柠檬酸铅(枸橼酸铅) 特点: A、密度大,对细胞各种结构都有亲和力, 尤其提高细胞膜系统和脂类物质的反差, 对核糖体、糖元等着色。常用 B、铅盐毒性大(防止皮肤吸收引起铅中 毒),易与CO2产生沉淀 3)高锰酸钾(KMnO4): 对膜染色好,与铀盐配合使用,当MNA做硬化剂 的环氧树脂包埋剂制作超切时发生化学反应。 方法:1%的KMnO4室温下染色10min 生物电子显微技术 3、染色的方法: A.单染: 铅盐单染,铀盐单染 铅盐比铀盐好,注意CO2的干扰 B.双染色: ① 醋酸双氧铀前染20~30min ② 漂洗掉多余染液 ③ 柠檬酸铅后染,15min 生物电子显微技术 返回 生物电子显微技术 返回 生物电子显微技术 生物电子显微技术 思考题 1.名词解释: 超薄切片 半薄切片 脱水 固定 缓冲液 电子染色 包埋 2. 简述普通超薄切片样品制备技术的基本过程. 3. 超薄切片机的基本构造及其工作原理。 4. 为什么要用支持膜?支持膜有哪些种类?其特 点是什么? 5. 什么是半薄切片?为何要制作半薄切片? 生物电子显微技术 6. 超薄切片时为什么要采用双固定法? 7. 简述包埋块修整的要求及原因. 8. 何谓合格的超薄切片? 9. 提高电镜的反差有哪些? 10. 超切中哪些步骤可以停留过夜? 11. 为何要对超切进行电子染色? 常用的电子染色有哪些 ?
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