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《微生物与发酵工程》第4章 发酵工业培养基及原料处理 1节

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微生物与发酵工程第4章发酵工业培养基及原料处理1节
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第四章第四章 发酵工业培养基及原发酵工业培养基及原 料处理料处理 培养基的营养 组成和 原料处理 培养基 培养基是指一切可供微生物细胞 也包括 动植物细胞 生长繁殖和积累代谢产物所需的人工 配制的营养物质和原料的总和 同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所 必须的条件 发酵培养基的概念 第一节第一节 发酵营养基质的组成发酵营养基质的组成 一 碳源营养 l微生物从总体上说几乎可以分解利用地球上 的一切有机物 但其碳源谱个体差异较大 总的来说 发酵上常用的碳源集中在糖类 脂类和烃类三种 糖类最常用 一 碳源营养 l葡萄糖 l优势 广谱碳源 几乎所有的微生物都能利用 l劣势 初糖效应 影响DO 且其代谢对很多发酵 产物有干扰 l解决方法 流加或连续发酵 l其他糖类 l单糖 双糖 多糖 有机酸 醇 酯 烃 l常用价格便宜的 如淀粉 但需预处理 一 碳源营养 l糖蜜 l糖蜜 molasses 是制糖工业的下脚料 将提纯的 甘蔗汁或甜菜汁熬成带有结晶的糖膏 用离心机 分出结晶糖 重复多次 至不能结晶 此母液即 糖蜜 l典型糖蜜的成分和性状 见下页表4 3 比较 项目 含糖 量 含水 量 蛋白 含量 灰分 无机 盐 PH 值 色泽气味 特点45 50 18 36 0 1 8 4 12 5 5 7 5 黄色 至褐 色 糖味 焦糖 味 表4 3 典型糖蜜的成分和性状 一 碳源营养 l由于我国制糖工业在南方和北方所用原料不同 所以糖蜜也主要有甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜两种 l糖蜜的品质因不同产地 不同产区土质 不同气 候 不同原料品种 不同收获季节 不同制糖方 法与工艺条件而有很大差异 l糖蜜主要应用在氨基酸 抗生素 酒精等发酵工 业上 一 碳源营养 l脂类 l含义 主要指各种长链脂肪酸 l常用物质 各种动物油和植物油 如各种菜油 豆油 棉子油 葵花子油 猪油 鱼油等 l常用菌种 如解脂假丝酵母等 l使用注意事项 乳化问题 供氧问题 一 碳源营养 l烃类 l常用物质 常以石油各个组分为原料 l常用菌种 即 石油微生物 如热带假丝酵母 解脂假丝酵母 嗜油毕赤氏酵母 脱蜡球拟酵母 以及某些假单胞菌等 l发酵行业 石油脱蜡 SCP生产 二 氮源营养 l凡是能被用来构成菌体物质中或代谢产物中 氮素来源的营养物质称为氮源 微生物整体 利用的氮源范围则称氮源谱 l象碳源谱一样 微生物的氮源谱也比较广大 但个体间差异较碳源谱小 NCHO型最易 利用 l除极少数具有固氮能力的微生物以外 微生 物的氮源都来自自然界中的无机氮或有机氮 物质 因此我们可以将氮源分为无机氮源和 有机氮源两种 二 氮源营养 l无机氮源 l常用物质 氨水 铵盐 硝酸盐 亚硝酸盐等 l特点 利用速度快 很多是速效氮源 某些利用后会改变培养基pH值 称这些 氮 源为生理酸 碱性物质 l氨水简介 l缺点 有些微生物不能利用 二 氮源营养 l有机氮源 l常用物质 主要是各种成分复杂的工农业下脚料 如各种豆粉 玉米粉 棉子饼粉 花生饼粉 各种蛋白粉 鱼粉 蚕蛹粉 某些发酵的废菌丝 体粉 酿酒工业的酒糟以及实验室常用的牛肉膏 蛋白胨等等 l特点 营养丰富 常为迟效氮源 二 氮源营养 l有机氮源 l玉米浆 概念 玉米浆是以玉米制淀粉或制糖中的玉米浸 泡水制得的 目前主要应用于抗生素工业 玉米浆由于浸泡使得营养十分丰富 使用注意 酸性 pH值约为4 质量波动 二 氮源营养 l尿素 亦称脲 CO NH2 2 相当于碳酸的二酰氨 外观 为白色晶体或粉末 是动物蛋白质代谢后的产物 应用范围 广泛 尤其在抗生素和氨基酸发酵中 使用注意 l中性氮源 l含氮量高 46 l微生物必须能分泌脲酶 l营养简单 二 氮源营养 蛋白胨 概念 外观呈淡黄色的粉剂 是具有某种类似肉 香的特殊气味 平均分子量在2000左右的氮素混 合物 使用注意 l营养成分的波动 l一般仅用于实验室 l防止吸潮 三 无机盐及微量元素 l概念 指除碳 氮元素外其他各种重要元素 及其供体 l划分 大量元素 10 3 10 4mol L 主要是P S K Mg Ca Na和Fe等 微量元素 10 6 10 8mol L 主要是Cu Zn Mn Mo和Co等 l使用 大量元素 盐 微量元素 有机碳 氮 源 高倍贮液 三 无机盐及微量元素 l磷元素 l细胞内存在 磷酸基团 以酯键与各种细胞组分 相连接 l作用 l细胞膜组分 l活化糖类分子 l共价修饰 l桥接核苷酸 l组成ATP 三 无机盐及微量元素 l常用供体 Na3PO4 K3PO4 Na2HPO4 NaH2PO4 K2HPO4 KH2PO4等 l注意事项 l 磷酸盐调节 现象 l有机碳 氮 源的使用 三 无机盐及微量元素 l硫元素 l细胞内存在 多以巯基或杂环硫形式存在 l作用 l蛋白质构象形成必需 l构成含硫维生素 l供体 硫酸盐 l注意事项 l有机碳 氮 源的使用 l产物含硫的发酵 三 无机盐及微量元素 l钙元素 l细胞内存在 二价离子 Ca2 形式 l作用 l很多酶的辅因子或激活剂 l渗透压调节剂 l供体 CaCl2 l注意事项 l不要与磷酸盐同时添加 l可以用CaCO3作为备用碱 三 无机盐及微量元素 l镁元素 l细胞内存在 二价离子 Mg2 形式 l作用 l很多酶的辅因子或激活剂 l叶绿素组分 l供体 MgSO4 l注意事项 l注意发酵培养基的pH值 三 无机盐及微量元素 l钾元素 l细胞内存在 一价离子 K 形式 l作用 l很多酶的辅因子或激活剂 l供体 KH2PO4和K2HPO4 三 无机盐及微量元素 l钠元素 l细胞内存在 一价离子 Na 形式 l作用 l调节渗透压 l某些特殊微生物所需 l供体 Na2HPO4 NaH2PO4 Na2SO4 NaCl l注意事项 l培养原生质体时注意盐浓度 三 无机盐及微量元素 l铁元素 l细胞内存在 二价离子 Fe2 形式存在 常与蛋白 质结合 l作用 l呼吸链重要组分 l供体 FeSO4 7H2O l注意事项 l注意不要过量添加 三 无机盐及微量元素 l微量元素 l细胞内存在 多以蛋白结合离子方式存在 l作用 l多为某酶的核心组分 l供体 在机碳 氮 源中含有 或使用高倍贮液 l注意事项 l绝对不可过量 在一些特殊发酵中要严格控制 表4 7 主要无机元素的来源和功能 引自周德庆等 1993 四 水 l作用 l起到溶剂与运输介质的作用 l参与细胞内一系列化学反应 l维持蛋白质 核酸等生物大分子稳定的天然构象 l高比热 高汽化热 高沸点 固态低密度 l供体 去离子水 蒸馏水 双蒸水或自来水 l注意 l自来水中的氯 l特殊发酵行业的要求 五 生长因子 l概念 生长因子是一类对微生物必不可少的 小分子有机物质 l范围 广义 维生素 碱基 卟啉及其衍生物以及某些 氨基酸等 狭义 仅指维生素 l主要维生素 各种B族维生素 常见维生素生理功能参见表4 9 表4 9 常见维生素生理功能 五 生长因子 l使用 一般也不需单独添加 常在有机碳 氮 源中含有 l常用供体 酵母膏 高倍维生素贮液 l生物素简介 生物素 biotin 是含硫原子的一元环状弱酸 是一种重要的生长因子 五 生长因子 l生物素简介 作用 是细胞内许多需ATP的羧化反应中羧基的 载体 羧基暂时与生物素双环系统上的一个氮原 子结合 如在丙酮酸羧化酶催化丙酮酸羧化成草 酰乙酸的反应中 使用 谷氨酸发酵中一般都使用生物素缺陷型的 菌株 发酵时控制生物素 亚适量 一般为5 g L左右 常用供体 纯品或由玉米浆或豆饼水解液提供 六 前体物质 l概念 前体是指一些添加到培养基中的物质 它们并不 促进微生物的生长 但能直接通过微生物的生物 合成过程结合到产物分子上去 自身结构基本不 变 而产物产量却因此有较大提高 l主要应用 氨基酸发酵和抗生素发酵 l使用注意 过量有毒 应先估算 再由实验确定用量 七 产物促进剂和抑制剂 l产物促进剂指在发酵过程中添加的 既不是 营养物又不是前体物质 但是却能提高产量 的物质 而产物抑制剂主要是一些对生产菌 代谢途径有某种调节能力的物质 这两者都 是对发酵过程有某种调节作用 使发酵过程 按照预定的路线进行或更有效率 l例如 甘露糖苷酶发酵中加入甘露聚糖 四 环素发酵中加入2 巯基苯骈噻唑 甘油发酵 加入亚硫酸氢钠等 微生物碳源谱 l微生物整体可以利用的碳源总范围称碳源谱 Spectrum of Carbon Sources 例如 糖类 葡萄糖 果糖 麦芽糖 蔗糖 淀粉 半 乳糖 乳糖 甘露糖 纤维纤维 二糖 纤维纤维 素 半纤纤 维维素 甲壳素 木质质素等 脂类类 各种植物油 动动物油 磷脂等 有机酸类类 乳酸 柠柠檬酸 延胡索酸 低级级脂肪 酸 高级级脂肪酸 氨基酸等 其他 如乙醇 石蜡 碳酸盐盐等 类 型 元素水平 化合物水平 培养基原料水平 有 机 碳 C H O N X复杂蛋白质 核酸等牛肉膏 蛋白胨 花生饼 粉等 C H O N多数氨基酸 简单 蛋 白质等 一般氨基酸 明胶等 C H O糖 有机酸 醇 脂 类等 葡萄糖 蔗糖 各种淀粉 糖蜜等 C H烃类天然气 石油及其不同馏 份 石蜡油等 无 机 碳 C C OCO2CO2 C O XNaHCO3NaHCO3 CaCO3 等 表4 1 微生物的碳源谱 表4 2 谷氨酸发酵水解糖液质量要求 表4 5 甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜的含糖区别 表4 4 不用加工方法对糖蜜质量的影响 类 型 元素水平化合物水平培养基原料水平 有 机 氮 N C H O X复杂蛋白质 核酸等牛肉膏 酵母膏 饼 粕粉 蚕蛹粉等 N C H O尿素 一般氨基酸 简单 蛋白 质等 尿素 蛋白胨 明胶 等 无 机 氮 N HNH3 铵盐 等 NH4 2SO4等 N O X硝酸盐等KNO3等 NN2空气 表4 5 微生物的氮源谱 生理酸性物质和生理碱性物质 NH4 2SO4 2NH3 H2SO4 NaNO3 8 H NH3 2H2O NaOH 例如硫酸铵和碳酸钠 经微生物代谢后形成酸性物质的无机氮源称为生理 酸性物质 经微生物代谢后形成碱性物质的无机氮 源称为生理碱性物质 图片来自阿里巴巴网 氨水简介 l概念 氨水是氨溶于水得到的水溶液 为无 色透明的液体 含氮12 16 易挥发 具有特殊的强烈刺激性臭味 氨水是一种弱 碱 pH值10左右 l应用 广泛 尤其是在氨基酸 抗生素等发 酵工业中 l功用 除做氮源还可兼做pH调节剂 l注意 过滤除菌 表4 6 玉米浆中各种氨基酸的含量 引自甘在红等 2007 表表4 8 4 8 一些微生物的生长因子一些微生物的生长因子 羧基与生物素的关系羧基与生物素的关系 肽链赖氨酸残基肽链赖氨酸残基 丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶 图图4 1 4 1 生物素在细胞内的作用生物素在细胞内的作用 表4 10 常见培养基原料生物素含量 引自俞俊棠 唐孝宣 生物工艺学 表4 11 一些氨基酸和抗生素发酵的前体物质 引自贺小贤 2003 前体使用的估算前体使用的估算 例 某厂青霉素产率要达到例 某厂青霉素产率要达到6000060000单位单位 ml ml的青霉素的青霉素GG 苯乙酸添加浓度是多 苯乙酸添加浓度是多 少 少 1 1单位青霉素单位青霉素 0 6 0 6微克微克 青霉素 青霉素 60000 0 660000 0 6 微克 微克 36mg ml36mg ml 苯乙酸 苯乙酸 36 13636 136 356 13 8mg ml 1 38 356 13 8mg ml 1 38 实际使用时的转化率在实际使用时的转化率在46 90 46 90 之间之间 若该厂苯乙酸单耗经实验为 若该厂苯乙酸单耗经实验为 0 3370 337 kg 10kg 10亿单位青霉素 则转化率是多亿单位青霉素 则转化率是多 少 实际添加量为多少少 实际添加量为多少 转化率为 转化率为 0 6 13 8 36 0 337 68 0 6 13 8 36 0 337 68 实际需求量实际需求量1 38 68 2 03 1 38 68 2 03 考虑到前体的毒性 以及氧化 挥发 价格等因素 实际添加量仅为考虑到前体的毒性 以及氧化 挥发 价格等因素 实际添加量仅为0 07 0 07 其余采用流加形式添加 其余采用流加形式添加 前体的用量可以按分子量衡算 具体使用有个转化率的问题前体的用量可以按分子量衡算 具体使用有个转化率的问题 青霉素G 分子量356 苯乙酸 分子量136 脱氢四环素 2 2 巯基苯骈噻唑巯基苯骈噻唑 在金霉素链霉菌的四环素发酵中加入抑氯剂 可使金霉素产量在金霉素链霉菌的四环素发酵中加入抑氯剂 可使金霉素产量 降至降至5 5 以下 以下 2ATP2ADP 2ADP 2ATP CO2 NaHSO3 NADH H NAD H2O Pi 葡 萄 糖 1 6 二磷 酸果 糖 3 磷酸甘 油醛 磷酸二羟丙 酮 丙酮酸 乙 醛 乙醛 HSO3 磷酸甘 油 甘 油 酵母酵母 型发酵型发酵 甘油发酵甘油发酵
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