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中药比较药代动力学研究思路与应用宋敏

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中药 比较 动力学 研究 思路 应用
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1 中药比较药代动力学研究思路与应用 宋敏博士 副教授 药物分析教研室 中国药科大学 2 中药研究现状 中药研究热点 质量控制 药效物质基础 质量控制 DNA分子标记技术建立部分动物药的鉴别方法 采用生物自显影技术 细胞膜技术 生物活性测定 等生物方法建立药材的定性鉴别和定量分析方法 采用 一标多测 技术建立多成分含量测定方法 采用指纹图谱分析法建立部分药材的整体质量控制 方法 逐步由单一指标性成分定性定量向活性 有效成分 及生物测定的综合检测过渡 3 v中药药代动力学 药效物质基础研究 目前 研究手段大多与化学药物相类似 针对已知活性 成分单体进行研究 但单味中药即是一个化学分子库 且有效成分不甚明确 相互间可能存在的影响关系不明 确 the kava extract increased the oral bioavailability of kawain in rat which was also the main cause of the adverse drug reaction Pharmacokinetics and disposition of the kavalactone kawain interaction with kava extract and kavalactones in vivo and invitro Drug Metab Dispos 2005 33 1555 1563 中药药代动力学研究现状 4 v中药药代动力学 药效物质基础研究 中药中化学成分存在相互影响 The coexisting ingredients in Gentiana manshurica had remarkable influence on the pharmacokinetics of gentiopicrin Studies on pharmacokinetics of gentiopicrin in longdan and its compound preparation in rats Chin Pharm J 2003 40 212 215 中药药代动力学研究现状 5 中药药代动力学 v有效成份单体与其在中药提取物中的体内过程并不 一致 势必在药理作用上得以体现 Such as dihydrotanshinone and cryptotanshinone were less active in acetylcholinesterase inhibitory when isolated Ren Y H Peter J H Robert C H Melanie Jayne R H 2004 Novel diterpenoid acetylcholinesterase inhibitors from Salvia miltiorrhiza Planta Med 2004 70 201 204 6 中药药代动力学 v药理作用差异 salvinolic acid B which is the main hydrophilic component in S miltiorrhiza Bge showed lower effective concentration in in vitro angiogenesis study than the crude extract Crude extract of Salvia miltiorrhiza and salvianolic acid B enhance in vitro angiogenesis in murine SVR endothelial cell line Planta Med 2003 69 26 32 v中草药间的相互配伍反应及与其他药物的相互作用 日益得到重视 但仍需进一步研究 7 挖掘丹参药材中共存组份之间可能存在的 相互影响情况 认识丹参药效物质基础 为临 床用药提供指导 为新药开发提供理论依据 第一部分 丹参提取物有效成分比较药代动力学 8 第一部分 丹参提取物有效成分比较药代动力学 v丹参水溶性成分 v丹参酯溶性成分 9 丹参水溶性成分 丹酚酸B和原儿茶醛 丹酚酸B 丹参水溶性成分中含量最高和药典 规定的含量测定指标成分 原儿茶醛 丹酚酸B在体外可能的降解产物 10 实验条件 v Thermo Finnigan Surveyor LC TSQ Quantum Ultra AM液相色谱串联四极 质谱系统 美国菲尼根质谱公司 v 色谱柱 Waters C18 250mm 4 6mm 5 m 预柱为C18 10mm 4 6mm 5 m v 流动相 甲醇 A 1 冰乙酸 B 为流动相 梯度洗脱 0min 40 A 4min 40 A 4 1min 80 A 10min 80 A v 流速 1 0mL min 1 柱后分流 0 3 mL min 1进入质谱检测器 v 进样量 20 l 一 原儿茶醛的药动学研究 11 质谱图 Mass spectra of protocatechualdehyde A and internal guaiacol B AB 12 A Blank plasma B Protocatechualdehyde added to blank plasma C protocatechualdehyde 200 0ng ml 1 tR 4 90min C Rat plasma sample taken 20min after ig of protocatechualdehyde C protocatechualdehyde 1002 7ng ml 1 tR 4 89min A BC 13 药动学试验设计 v Sprague Dawley大鼠6只 雌雄各半 体重250 10g 由南京医科大学动物实验中心提供 大鼠于受试 的前晚起禁食 不禁水 于灌药4小时后给食 大鼠 灌胃给药原儿茶醛62 mg kg 1 分别于给药后2 5 10 15 20 30 40min和 1 0 1 5 2 0 3 0h从眼 底静脉丛取血0 5mL 置肝素钠抗凝处理过的试管 中 3000 r min 1离心10min 转移血浆 置 20 保 存待测 14 原儿茶醛药 时曲线 Mean plasma concentration time curve after ig protocatechualdehyde 62mg kg 1 in rat 达峰时间在10 15min 而后以极快的速度消 除 180min后只能测到少数大鼠的血药浓度 15 色谱条件与质谱条件 v 质谱条件 丹酚酸B是三分子丹参素和一分子 咖啡酸的缩合物 虽然在负离子监测 模式下也可生成m z717的 M H 继 而经二级碰撞脱去一分子丹参素产生 子离子m z519 M 198 H 但在相同 的碰撞能量下也可生成脱去两分子丹 参素的子离子m z321 两者丰度相差 不大 不够稳定如图所示 相比较正 离子监测模式下 M Na 峰m z741较 稳定 且其子离子m z561为脱去一分 子咖啡酸后生成 丰度较强 因此被 选用 A B A Negative mode B Positive mode 二 丹酚酸B的药动学研究 16 丹酚酸B在大鼠体内的药 时曲线 Mean plasma concentration time curve of salvianolic acid B after ig salvianolic acid B 260mg kg 1 in rat 17 三 丹参水溶性提取物的中 丹酚酸B和原儿茶醛的药动学 灌胃试液的配制 v取丹参干燥药材粉末500g 水1000mL提取三次 每次 1hour 过滤后滤液浓缩 再分别用60 85 和95 的乙醇沉淀鞣质 过滤 滤液减压浓缩至干 用适量 生理盐水溶液即得 HPLC UV测定其中丹酚酸B含量 为26mg mL 原儿茶醛为6 2mg mL 18 血药浓度经时过程 大鼠灌胃给药丹参水提物 其中相当于丹酚酸B 260mg kg 1和原 儿茶醛62mg kg 1 后的丹酚酸B和原儿茶醛的药 时曲线 Mean plasma concentration time profiles of salvianolic acid B and protocatechualdehyde in rat after ig of Danshen water soluble extract 19 小结与讨论 v 原儿茶醛 大鼠灌胃给药原儿茶醛 单体后的AUC为64754 0 ng ml min 而灌胃给药含有相同含 量原儿茶醛的丹参水提物后 其 AUC只有25067 9 ng ml min 即 单体给药的AUC为提取物给药的2 6 倍 Cmax为5 1倍 MRT为0 4倍 可见原儿茶醛单体给药时吸收较好 而消除快 以提取物方式给药后 的原儿茶醛呈一房室模型 即只在 中央室少量吸收 未向周边室分布 就开始消除 Comparison of the plasma concentration time profiles of protocatechualdehyde 20 小结与讨论 v 丹酚酸B 以提取物方式给药后 的丹酚酸B的AUC为98904 3 ng ml min 是单体方式给药后 的AUC 为22569 4 ng ml min 的4 4倍 Cmax为3 4倍 MRT 为1 5倍 即提取物方式给药使 丹酚酸B的吸收变好了 消除减 慢了 可能的原因包括提取物 中的并存成分促进了丹酚酸B的 吸收并减缓其消除 或其它成 分的代谢转化 Comparison of the plasma concentration time profiles of salvianolic acid B 21 小 结 经过大鼠原儿茶醛和丹酚酸B的药动学比较研究可知 丹参药材水溶性提取物中的其他组份可直接影响原儿 茶醛和丹酚酸B的吸收及消除 分别对它们产生抑制和 促进作用 因此 利用中药中含有的 标志成分 的纯品 或标准品 进行药动学研究是必要的 这也是目前中 药药动学研究的重要方法 可以提供较好的参考 但却 不能以此代替中药材提取物或中药复方制剂 更复杂 的药动学研究 22 丹参脂溶性成分的大鼠药代动力学研究 同时分析检测7个活性成分 获得其中5个成分的大鼠体内 的经时过程 Mean ratio time profile of several compounds in Danshen acetic ether extract 23 药代动力学试验设计 Sprague Dawley大鼠18只 平分为3组 每组雌雄各半 体 重250 10g 大鼠于受试的前晚起禁食 不禁水 于给药4小时 后进食 3组大鼠分别灌胃给药 丹参酮 A单体8 0mg kg 1 隐丹参酮单体5 7mg kg 1 丹参脂溶性提取物 相当于分别含隐丹参酮 丹参酮 A为5 7和8 0 mg kg 1 分别于给药后5 10 15 20 30 40min和 1 0 2 0 4 0 8 0 12 0 24 0h从眼底静脉丛取血0 5mL 置肝素钠抗凝处 理过的试管中 3000 r min 1离心10min 转移血浆 置 20 保 存待测 24 药代动力学结果 1 Mean concentration time profiles of cryptotanshinone in rat plasma after intra gavage of cryptotanshinone 5 7 mg kg and tanshinones extract 23 3 mg kg mean S D n 6 The Cmax and AUC were significantly different P 0 001 25 Mean concentration time profiles of tanshinone IIA in rat plasma after intra gavage of cryptotanshinone 5 7 mg kg tanshinone IIA 8 0 mg kg and tanshinones extract 23 3 mg kg mean S D n 6 药代动力学结果 2 26 结果分析与讨论 u1 灌胃丹参酮 A 或隐丹参酮单体后丹参酮 A 的药动学结果比较 根据隐丹参酮的代谢物丹参酮 ATmax为25min可以发现 隐丹参 酮在大鼠体内很快就发生脱氢反应被代谢丹参酮 A 灌胃丹参酮 A 8mg kg时AUC为499 37ng ml min还没有灌胃隐丹参酮5 7mg kg时代谢 产生的丹参酮 A的AUC为560 68ng ml min高 说明丹参酮 A的口服 吸收很不好 比较灌胃丹参酮 A和灌胃隐丹参酮后丹参酮 A的消除半衰期 经方差分析 P 0 46 0 05 结果表明两者无明显差异 丹参酮 A 隐丹参酮 27 结果分析与讨论 u2 灌胃隐丹参酮单体或丹参脂溶性提取物后隐丹参酮 的药动学结果比较 cryptotanshinone compartment model CmaxTmaxt1 2AUC Tn ng mLminminng ml min ig cryptotanshinoneOne9 7833 3172 662346 60 ig extractTwo51 4535 00464 928822 31 P0 008 0 050 734 0 050 082 0 050 027 0 05 灌胃丹参酮提取物后所测得的隐丹参酮的Cmax和AUC Tn 分别提高了5 3倍和 3 8倍 说明 丹参酮提取物中的其他成份可促进药效成份隐丹参酮的吸收从而对其 药动学行为产生明显的影响 大鼠分别灌胃给予隐丹参酮单体和丹参酮提取物后 隐丹参酮的药 时曲线分别 符合一 二房室模型 Tmax无差异 说明提取物中的其他成份对使隐丹参酮在大鼠 体内的吸收速度加快 同时使其从中央室向周边室分布 28 tanshinone A compartment model CmaxTmaxt1 2 AUC Tn ng mLminminng ml min ig cryptotanshinoneTwo3 5825 0331 22560 68 ig tanshinone ATwo3 4019 2293 16499 37 ig extractTwo34 0438 3462 629257 19 P0 003 0 051 23E 6 0 050 357 0 050 004 0 05 结果分析与讨论 u3 灌胃丹参酮 A单体或丹参脂溶性提取物后丹参酮 A的药动学结果比较 灌胃丹参酮提取物后所测得的丹参酮 A的Cmax和AUC Tn 分别提高了10 0倍和 18 5倍 说明 丹参酮提取物中的其他成份可促进药效成份丹参酮 A的吸收 影响其代 谢消除 或存在转化 从而对其药动学行为产生明显的影响 对于大鼠分别灌胃给予丹参酮 A 隐丹参酮单体和丹参酮提取物后 丹参酮 A的 药动学参数比较可以发现 在丹参酮提取物中的其他组份可协同促进丹参酮 A在大鼠体 内的吸收的同时 隐丹参酮也脱氢反应代谢产生丹参酮 A 两种作用的加合致使丹参酮 提取物组丹参酮 A的AUC为丹参酮 A组的18 5倍 Tmax的显著性差异也说明这一点 与文献报道从十二指肠给药情况相一致 29 第一部分 结 论 丹参提取物比较药代动力学研究结果表明 中 药材中的其他成分对其 标志成分 或 药效成分 的 体内过程有较大的影响 拮抗 原儿茶醛 协同 丹酚酸B 丹参酮 A及隐丹参酮 促进转化 隐丹参酮代谢为丹参酮 A 30 第二部分 复方中药药代动力学 v有效成份单体与其在中药提取物中的体内过 程并不一致 复方中药成分更加复杂 是否 也存在相互作用 some ingredients in the Huang Lian Jie Du Tang had pharmacokinetic interaction with baicalin and wogonoside Comparative pharmacokinetics of baicalin after oral administration of pure baicalin Radix Scutellariae extract and Huang Lian Jie Du Tang to rats J Ethnopharmacol 2007 110 412 418 31 第二部分 复方丹参制剂比较药代动力学 丹参和三七配伍后主要活性 成分药代动力学相互作用 探讨 它们的配伍机制 32 复方丹参方的药代动力学研究 v 复方丹参方由丹参 三七和冰片三味药 材组成 v 是活血化瘀的名方 广泛用于治疗冠心 病 心肌梗塞 心绞痛 抗血栓等心血 管疾病 v 来源于丹参的酚酸类成分和二萜醌类成 分及来源于三七的皂苷类成分是复方丹 参方中的主要药效物质 33 复方丹参方主要活性成分结构 三七皂苷R1人参皂苷Rg1人参皂苷Rb1 酚酸类成分 二萜醌类成分 皂苷成分 34 受试灌胃混悬液的制备和含量测定 丹参灌胃液 丹参片30片 CMC Na制 备 三七灌胃液 三七片20片 同法制备 丹参 三七配伍灌胃液 丹参片30片 三七片20片 同法制备 含量测定 mg mL 1 丹参三七丹参 三七 丹参素0 21 0 21 紫草酸 0 44 0 44 迷迭香酸 0 27 0 27 丹酚酸B 4 05 4 05 丹酚酸 A 0 16 0 16 丹参酮酮 A 0 19 0 19 隐隐丹参酮酮 0 20 0 20 三七皂苷R1 0 460 46 人参皂苷Rg1 1 751 75 人参皂苷Rb1 2 022 02 35 药代动力学试验设计 v 三周期自身对照试验设计 v 健康比格犬8只 雌雄各半 给药剂量均为1ml kg v 周期1 丹参混悬液 相当于丹参素0 21 mg kg 1 丹参酮 A0 19 mg kg 1 隐丹参酮0 20 mg kg 1 v 周期2 三七混悬液 相当于三七皂苷R10 46 mg kg 1 人参 皂苷Rg11 75 mg kg 1和人参皂苷Rb12 02 mg kg 1 v 周期3 丹参 三七配伍混悬液 灌服前及灌服后0 25 0 5 1 1 5 2 3 4 5 6 8 12 24 48 72 96和120 h分别经前肢静脉取血约3 5mL 置肝素化离心管中 900 g离心10 min分取血浆 于 80 避 光保存供血药浓度测定用 比格犬经过足够长的清洗期后开始下一周期试验 36 血药浓度测定结果 配伍前后药动学行为有显著差异 丹参素 三七皂苷R1 人参皂苷Rg1 人参皂苷Rb1 配伍后 AUC减少 44 Cmax显著 降低 t1 2缩短 清 除速率加快 配伍后 AUC显著 降低 Cmax显著减 小 CLz F增大 配伍后 AUC显著 降低 Cmax显著减 小 Tmax延后 CLz F未见明显变化 37 血药浓度测定结果 配伍前后药动学行为无显著差异 丹参酮 A 隐丹参酮 38 小结与讨论 v 药动与药效 配伍对于丹参素和三个皂苷成分的药代动力 学行为有较大影响 但这并不一定意味着中药配伍后整体 药效的下降 丹参 三七配伍作为经典的药对 其活血化 瘀的疗效优于单味药已久经考验 文献报道 人参皂苷Rb1 对于心肌细胞长时程增强的活性在5nmol时出现最大值 人 参皂苷Rg1和Rb1均在浓度为40 g mL 1时有最强的神经保 护作用 而在更高剂量时无作用甚至出现反作用 v 肠道菌群作用 皂苷成分口服进入体内后 大部分在肠道 菌群的作用下水解生成其代谢产物 仅有小部分能进入体 内循环 39 Publications vMin Song Tai jun Hang Zhengxing Zhang Hong Yuan Chen Effects of the coexsting diterpenoid tanshinones on the pharmacokinetics of cryptotanshinone and tanshinone A in rat European Journal of Pharmaceutical Sciences 2007 32 247 253 IF 3 127 v宋敏 杭太俊 张正行 隐丹参酮及丹参酮提取物在大鼠体内药动学比较研究 中国药学杂志 2008 43 1 51 54 vMin Song Tai jun Hang Zheng xing Zhang et al Determination of cryptotanshinone and its metabolite in rat plasma by liquid chromatography tandem mass spectrometry J Journal of Chromatography B 2005 827 205 209 IF 2 77 v宋敏 杭太俊 张正行 丹参提取物有效成分在大鼠体内的药代动力学和相互影 响研究 药学学报 2007 42 3 301 307 v张丝韵 宋敏 卢俊刚 杭太俊 丹参与三七配伍对主要活性成分药代动力学行 为的影响 药学学报 in print vMin Song Siyun Zhang Xiaoyan Xu Taijun Hang Lee Jia Simultaneous determination by LC MS MS of three Panax notoginseng saponins at sub nanograms in dogs from oral Compound Danshen Tablets Journal of Chromatography B in print 40 谢 谢
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