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精品体外抗菌药物抑菌试验(亦称细菌对药物的敏感试验简称药课件

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精品 体外 抗菌 药物 试验 细菌 敏感 简称 课件
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单击此处编辑母 版标题样式 单击此处编辑母版副标 题样式 1 体外抗菌药物抑菌 试验 亦称细菌对 药物的敏感试验 简称药敏试验 v病原生物学实验室 v2009 3 4 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 一 概念 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial v药物敏感试验是在体外检测抗菌药物对 细菌的抑制和杀灭的作用 根据药物的 常规剂量在体内所能达到的浓度对细菌 的影响 将被检菌株对该药的敏感程度 分为三级 敏感 中度敏感 中介度 耐药 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial v敏感 S 表示细菌可被常规剂量的药物在体内达到 的浓度所抑制或杀灭 v中度敏感 MS 表示细菌可被该药物大剂量的浓度 所抑制或在药物生理性浓集的部位被抑制 只有少数药物可报告中度敏感 如氨苄青霉素测肠 球菌 v中介度 1 是为防止因技术因素失控导致结果误差 而设置的 缓冲域 因其临床意义难以确定 故不应 向临床医师报告 而应重做稀释法根据MIC结果做 出判断 v 耐药 R 表示细菌不能被常规剂量的药物所达到 的浓度所抑制 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 药物在体外稀释的不同浓度对细菌 生长的影响 可分为二种 v 最小抑菌浓度 MIC 抗菌药物能抑制 被检菌生长的最小浓度 药物对同一菌 株MIC值越小 其抗菌力就越强 细菌 对这种药物就越敏感 v 最小杀菌浓度 MBC 抗菌药物能完 全杀灭被检菌所需要的最小浓度 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial v近年来 广谱和超广谱抗菌药物的应用 及滥用 造成耐药菌株数迅速增加 耐 药范围不断扩大 导致抗菌治疗效果严 重下降 耐药菌引起的内源性感染和医 院交叉感染已成为全球性的突出问题 如何指导科学合理地抗菌治疗及耐药监 测已成为微生物实验室及临床微生物实 验室的重要任务之一 体外检测抗菌药 物对细菌的敏感试验作为实验室的主要 手段 在临床医学中有着重要的作用 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 二 药敏试验的常用方法 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial vK B纸片扩散法 肉汤稀释法 琼脂稀 释法及 E test法试验 前面讲过药物对同一菌株 MIC值越小 其抗菌力就越强 K B法的抑菌圈 环 就越大 细菌对这种药物就越敏感 这是K B 纸片扩散法与稀释法的关系 呈负相关 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 一 K B纸片扩散法 v是由Kirby和Bauer所创建 此方法属定性试验 是 药敏试验中最成熟的方法之一 但操作时影响因素 较多 需注意质控 经世界卫生组织推荐统一实验 条件 规定了统一用水解洛蛋白培养基及平板大小 培养基厚度 标准菌株 菌龄及菌浓度 操作手 法 纸片质量及厚度 药敏纸片之间距离 观察量 取结果时间及工具 为各国广泛采用的方法 v根据本国国情 卫生部临床检验中心还制订了关于 临床微生物实验室室内质控要求 临床具体工作须 参照遵守 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial v原理 是将定量抗菌药物纸片贴在涂有细菌的 琼脂平板上 抗菌药物在琼脂内向四周扩散 其浓度逐渐递减 使纸片周围的敏感细菌 受到抑制生长 形成抑菌圈 测量抑菌圈的 直径来判定细菌对药物的敏感程度 此法简 单易行 价格便宜 药物选择灵活 适用对 生长快的细菌进行药敏试验 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 1 水解酪蛋白琼脂 Mueller Hinton AgarMHA 倾注成4mm厚的12 15cm平板 将其保 存于4 冰箱可用1周 2硫酸钡比浊管 1 175 氯化钡 BaCl2 2H2O 0 5ml加0 36N 1 流酸溶液99 5ml 充分混匀 每管4ml其浊度相当于0 5麦氏 McFarland standard 比浊管第一管1 2 1 5亿 ml相当于1 5 108CFU m1 使用期 半年 材料 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 3 抗菌素纸片 现有商品 阿米卡星 AMK 庆 大霉素 GEN 青霉素 PEN 苯唑西林 OXA 氨苄西林 AMP 氨苄西林 舒巴坦 AMS 呢拉西林 PIP 头抱唑林 FZN 头 孢呋辛 FRX 头孢他啶 CAZ 氨曲南 ATM 亚胺配南 1MP 环丙沙星 CIP 万古霉素 VAN 克林霉素 CLI 复方新诺 明 SXT Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 4 质控菌 金黄色葡萄球菌 ATCC25923 大肠埃希菌 ATCC25922 5 其它 无菌生理盐水 无菌棉拭 镊子 游 标毫微米卡尺 消毒小试管 1ml 10ml 吸 管 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 操作方法 1 将金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌先接种 在血平板或营养平板上 37 孵育16 24h 2 再将菌落接种至营养肉汤中 培养4 6 小时后用灭菌生理盐水校正菌液浓度至 0 5麦氏标准比浊管 相当于1 5 108CFU m1 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 3 用灭菌棉拭子蘸取相当于1 5 108CFU m1的 金黄色葡萄球菌菌液 在试管内壁旋转挤去 多余菌液后 在MHA 平板表面上 从不同方 向均匀涂布3次 每次旋转平板60度 最后沿 平板内缘涂抹1圈 同样方法涂布大肠埃希菌 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 4平板在室温下干燥3 5min后 根据试验菌 株选择抗菌谱 如阳性球菌 金黄色葡萄球菌 选择青霉素 PEN 苯唑西林 OXA 环丙沙 星 CIP 万古霉素 VAN 克林霉素 CLI 等 大肠埃希菌选用氨苄西林 AMP 头抱唑 林 FZN 庆大霉素 GEN 环丙沙星 CIP 亚胺配南 IMP 等 5用无菌镊子将含药纸片 紧贴于琼脂表面 各纸片之间相距应大于24mm 纸片距平板 内缘应大于15mm 置37 孵育18h 24h观 看结果 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 结果 v纸片周围的细菌受抑制 形成明显的抑菌圈 用游标卡尺测量抑菌环直径的大小记录之 v参考表中的质量控制标准 报告敏感 S 耐药 R Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 注意事项 v标准菌株的抑菌圈应落在表中所示的预期范 围内 如果超出该范围 应视为失控 须及 时查找原因 予以纠正 v培养基的质量 药敏纸片的质量 接种菌量 试验操作质量 孵育条件 抑菌圈测量工 具的精度 质控菌株的药敏特性等均能影响 结果的准确性 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 二 肉汤稀释法 及琼脂稀释法 v原理 是用水解酪蛋白肉汤 MH 或水解 酪蛋白琼脂 MHA 培养基作为稀释剂 按 美国委员会临床实验室标准 作 分步倍比稀释抗菌药物 定量加入被检 菌株 经培养后观察抗菌药物的最小抑 菌浓度 MIC 和最低杀菌浓度 MBC Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 优缺点 v稀释法是直接定量地检测抗菌药物在体 外对病原菌的抑制或杀灭浓度 有利于 临床根据MIC 药物代谢等拟定合理的 治疗方案 是目前厌氧菌的最佳测定方 法 琼脂稀释法还易于发现污染或耐药 突变菌 稀释法是新药开发 体外药敏 试验常用的经典参照标准 但操作相对 比较烦琐 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 材料 肉汤稀释法 v标准菌株ATCC25923 待测菌株 金 黄色葡萄球菌6h菌液 MH肉汤 头孢 霉素或青霉素注射粉剂 无菌蒸馏水 0 1mol L消毒磷酸盐缓冲液 0 5麦氏标 准比浊管 相当于1 5 108CFU m1 吸 头 无菌中试管 小试管或无菌96孔聚 苯乙烯U型板 微量加样器 湿盒 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 操作方法 v药物原液配制 原液浓度常为测定浓度的10倍以上 根据药 物性能选择溶剂 例如 取青霉素钾注射粉剂80万u 支 蒸馏水 4ml 20万u ml 取1ml 9mlMH 肉汤 2万 u ml 取2万u ml的5 12ml药液 MH肉汤 14 88ml 5120 u ml 分装4ml 支 20 保 存 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial v常用的原液浓度 肉汤稀释法为1280u g ml 琼脂 稀释法为5120u g ml 具体的 还应根据某药的抑菌特性而定 最好 用灭菌溶剂配制 如需要 原液配制 好后用过滤法除菌 小量分装备用 大部分抗菌药物原液在 20 以下可 保存3个月 但在4 下只能保存1周 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 测定浓度稀释 参照下表 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 测定浓度稀释文字说明 取试管15支 编好管号 加MH肉汤1ml于2 4 7 10 13试管内 加MH肉汤3ml于3 5 8 10 11试管内 加MH肉汤7ml 于6 9 12 15试管内 然后分别 加入药物原液 5120u m1 1ml于1 2 3管内 从3管吹吸后 分别放入4 5 6各管1ml 从6管吹 吸后 分别放入7 8 9管中各1ml 从9管吹吸后 分别放入10 11 12管内各1ml 从12管内吹吸 后分别放入13 14 15管内各1ml 药物的浓度依 次为5120 2560 1280 640 320 160 80 40 20 l0 5 2 5 1 25 0 625 0 31u ml Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 测定方法 v试管法MIC 将按上表稀释的浓度再稀释10倍 各管中抗菌药物的终浓度依次为128 64 32 16 8 4 2 1 0 5 0 25 0 12 0 06 0 03u ml 各 浓度取1ml加入已标记好的小试管内 以无药物MH肉汤为空白对照及生 长对照 以另一排为质控菌对照 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 每管加菌液50 l 含菌量达到105 CFU m1 测试菌和质控标准菌的准备 增菌 培养同K B法 4 6小时幼龄菌用3 5m1生理盐水校正浓度至0 5麦氏比浊标 准 再用MH肉汤1 100稀释 加完后 轻摇 置37 孵育18 24 h观察结果 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial v 微量法MIC 同试管法 各管中抗菌药物的 终浓度依次为128 64 32 16 8 4 2 1 0 5 0 25 0 12 0 06 0 03u ml 各浓 度取200微升加入消毒的微量反应板内 以无 药物MH肉汤为空白对照及生长对照 以另一 排为质控菌对照 每孔加菌液10 l 含菌量达到105 CFU m1 测试菌和质控标准菌的准备 同试管法 置37 孵育18 24 h观察结果 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial MIC结果判断 v先观察对照管应有细菌生长 然后逐管 与对照比较 不出现肉眼可见生长的最 低药物浓度为该药对测试菌 或标准菌 的MIC 每次实验时应选用标准菌株在 同一试验条件下进行测定 以控制质量 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 三 琼脂稀释法MIC v 药液稀释同上 见表 取每浓度各2m1加入 已作好标记的90mm消毒平皿内 加入50 的MHA18ml 使药物和培养基充分混匀 冷 却后分区域接种 以无药物MHA为对照 药物 终浓度即512 256 128 64 32 16 8 4 2 l 0 5 0 25 0 125 0 0625 0 031u ml 比原来稀释了10倍 每平皿可分4 6区 接种4 6个菌株 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial v 细菌接种 每格可用内径4mm外径 6mm接环或加样器 划线或用加样器多 点接种10 l每点2 l 接种时先接种含药 浓度低的平板 然后接种含药浓度高的 平板 最后接种不含抗菌药物的平板 以检查整个实验过程中测试菌的存活状 态 置37 孵育18 24 h观察结果 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 结果 v菌落生长被完全抑制的最低药物浓度为该药 对检测菌的MIC 单一菌落生长可忽略不计 v 影响因素 培养基 接种菌量 蛋白质结合 率 抗菌药物的配制 结果观察的时间等因 素均能影响结果 此外 肉汤稀释法不适于 作磺胺药或三甲氧苄氨嘧啶等抑菌剂的药敏 试验 因为敏感菌株在被抑制前已可繁殖数 代 从而使结果的终点不清 而应用琼脂稀 释法可获满意的结果 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 质量控制 v每个平板同时接种标准菌株 测试结果 不能超过或低于标准菌株MIC的预期值 范围 如超过或低于预期值范围一个稀 释度以上时 应检查原因 标准菌株是否 被污染或已变异等 并重复测定 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 四 E test法实验 v是扩散法和稀释法相结合的一种药敏方法 是以抗 菌药物的梯度浓度试条 与宽5mm长50mm的塑料试 条相粘合 用数字标出所含该药物的浓度刻度 g ml 将试条贴在含有细菌的琼脂表面上 v原理 抗菌药物在琼脂 内向四周扩散 使敏感细菌 在一定范围内受到抑制生长 形成抑菌圈 抗菌药 物的浓度呈连续梯度递减 使抑菌圈的大小随药物 浓度的递减而变化 根据试条两侧抑菌圈与试条相 交位置的刻度数值 准确 定量地测出抗菌药物对 某菌的最低抑菌浓度 MIC Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial v优点 操作简单 定量检测 结果直观准确 重复性好 具有扩散法与稀释法相同效果 v材料 方法 注意事项等与K B 大致相同 略 v结果 围绕试条可形成一个椭圆形的抑菌圈 抑菌圈和试条的横向相交处的读数刻度即 是该测定抗菌药物对测试菌的最低抑菌浓度 MIC Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 判定E试验 MIC的方法 v试条两侧的抑菌圈与试条相交处 1 位于试条上所示上下刻度之间时 读取 较高的一侧所示的读数 2 两侧的抑菌圈与试条相交处不一致时 读 取刻度数值较高的一侧所示的读数 3 沿药敏试条边缘生长的细菌线在阅读结果 时可忽略不计 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 1 2 3 4 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 4 内酰胺酶抑制剂因其固有活性等原因可 能会导致沿药敏试条的下端形成一下延的抑 菌圈 此时的MIC应是椭圆形抑菌圈正常椭 圆线的延伸与药敏试条相交处的刻度读数 5 在椭圆形抑菌圈与药敏试条相交处或圈内 有小菌落或大菌落时 应读生长被完全抑制 的部分与药敏试条相交处的读数 6 出现双抑菌圈时 应读生长被完全抑制的部 分与药敏试条相交处的读数 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 7 测试抑菌抗菌药物时 或接种菌量过高时 应读80 抑菌部分或生长被明显抑制的部分 与药敏试条相交处的读数 8 当椭圆形抑菌圈在与药敏试条相交处呈凹下 延伸时 阅读凹下起始处椭圆形切线的读数 一般高于完全抑制部位0 5 1个稀释度 Five weeks of practice ended in this way and my feelings can only be summed up in eight words although hard but very substantial 注意 v质量控制基本与稀释法相同 应掌握E试验药 敏试条的正确使用和储存方式 如涂菌后一 定要待琼脂表面干燥后方可置入药敏试条 单击此处编辑母 版标题样式 单击此处编辑母版副标 题样式 42 7F4C0z w s pYmUjRfOcL9H6E3B y u r oWlTiQeNbJ8G5D1A x t qYnVkSgPdMaI7F3C0z v s pXmUiRfOcK9H6E2B y u rZoWlThQeNbJ8G4D1A w t qYnVjSgPdLaI7F3C0y v s pXmUiRfNcK9H5E2B x u rZoWkThQeMbJ7G4D1z w t qYnVjSgOdLaI6F3C0y v s pXlUiRfNcK8H5E2A x u rZnWkThPeMbJ7G4C1z w t qYmVjRgOdL9I6F3B0y v s oXlUiQfNbK8H5D2A x u rZnSgOdLaI6F3C0y v s pXlUiRfNcK8H5E2A x u rZnWkThPeMbJ7G4C1z w t qYmVjRgOdL9I6F3B0y v s oXlUiQfNcK8H5D2A x u rZnWkShPeMaJ7G4C1z w t pYmVjRgOcL9I6E3B0y v r oXlTiQfNbK8G5D2A x u qZnVkShPdMaJ7F4C1z w s pYmUjRgOcL9H6E3B y v r oWlTiQeNbK8G5D1A x t qZnVkSgPdMaI7F4C0z v s pXmUjRfOcK9H6E2B y u r oWlThQeNbJ8G5D1A w t qYnVkSgPdLaI7F3C0z v s pXmUiRfOcK9H5E2B x u rZoWkThQeMbJ8G4D1z w t qYnVjSgOdLaI6F3C0y v s pXlUiRfNcK9H5E2A x u rZoWkThPeMbJ7G4D1z w t qYmVjSgOdL9I6F3B0y v s oXlUiQfNcK8H5D2A x u rZnWkThPeMaJ7G4C1z w t pYmVjRgOdL9I6E3B0y v s oXlTiQfNbK8H5D2A x u qZnWkShPdMaJ7F4C1z w s pYmUjRgOcL9I6E3B y v r oXlTiQeNbK8G5D2A x tmVjRgOdL9I6E3B0y v s oXlTiQfNbK8H5D2A x u qZnWkShPdMaJ7F4C1z w t pYmUjRgOcL9I6E3B y v r oXlTiQeNbK8G5D2A x t qZnVkShPdMaI7F4C0z w s pXmUjRfOcL9H6E2B y u r oWlTiQeNbJ8G5D1A x t qYnVkSgPdMaI7F3C0z v s pXmUiRfOcK9H6E2B x u rZoWlThQeMbJ8G4D1A w t qYnVjSgPdLaI6F3C0y v s pXmUiRfNcK9H5E2B x u rZoWkThQeMbJ7G4D1z w t qYmVjSgOdLaI6F3B0y v s pXlUiQfNcK8H5E2A x u rZnWkThPeMbJ7G4C1z w t qYmVjRgOdL9I6F3B0y v s oXlUiQfNbK8H5D2A x u qZnWkShPeMaJ7F4C1z w t pYmUjRgOcL9I6E3B0y v r oXlTiQfNbK8G5D2A x u qZnVkShPdMaJ7F4C0z w s pYmUjRfOcL9H6E3B y u r oWlTiQeNbJ8G5D1A x t qYnVkSgPdMaI7F4C0z v s pXmUjRfOcK9H6E2B y u rZoWlThQeNbJ8G4D1A w t qYnVjSgPdLaI7F3C0y v s pXmUiNbK8G5D1A x t qZnVkSgPdMaI7F4C0z v s pXmUjRfOcK9H6E2B y u rZoWlThQeNbJ8G4D1A w t qYnVjSgPdLaI7F3C0y v s pXmUiRfOcK9H5E2B x u rZoWkThQeMbJ8G4D1z w t qYnVjSgOdLaI6F3C0y v s pXlUiRfNcK8H5E2A x u rZnWkThPeMbJ7G4D1z w t qYmVjSgOdL9I6F3B0y v s oXlUiQfNcK8H5D2A x u rZnWkShPeMaJ7G4C1z w t pYmVjRgOcL9I6E3B0y v s oXlTiQfNbK8H5D2A x u qZnWkShPdMaJ7F4C1z w s pYmUjRgOcL9H6E3B y v r oWlTiQeNbK8G5D1A x t qZnVkSgPdMaI7F4C0z w s pXmUjRfOcL9H6E2B y u r oWlThQeNbJ8G5D1A w t qYnVkSgPdLaI7F3C0z v s pXmUiRfOcK9H5E2B x u rZoWlThQeMbJ8G4D1A w t qYnVjSgPdLaI6F3C0y v s pXlUiRfNcK9H5E2A x u rZoWkThPeMbJ7G4D1z w t qYmVjSgOdL9I6F3B0y v s pXlUiQfNcK8H5E2A x u rZnWkThPeMaJ7G4C1z w t pYmVjRgOdL9I6E3B0y v s oXlTiQfNbK8H5D2A t qYmVjSgOdLaI6F3B0y v s pXlUiQfNcK8H5E2A x u rZnWkThPeMaJ7G4C1z w t pYmVjRgOdL9I6E3B0y v s oXlUiQfNbK8H5D2A x u qZnWkShPeMaJ7F4C1z w t pYmUjRgOcL9I6E3B y v r oXlTiQeNbK8G5D2A x t qZnVkShPdMaI7F4C0z w s pYmUjRfOcL9H6E3B y u r oWlTiQeNbJ8G5D1A x t qYnVkSgPdMaI7F3C0z v s pXmUiRfOcK9H6E2B x u rZoWlThQeNbJ8G4D1A w t qYnVjSgPdLaI7F3C0y v s pXmUiRfNcK9H5E2B x u rZoWkThQeMbJ7G4D1z w t qYmVjSgOdLaI6F3B0y v s pXlUiRfNcK8H5E2A x u rZnWkThPeMbJ7G4C1z w t qYmVjRgOdL9I6F3B0y v s oXlUiQfNbK8H5D2A x u qZnWkShPeMaJ7G4C1z w t pYmVjRgOcL9I6E3B0y v r oXlTiQfNbK8G5D2A x u qZnVkSL9I6F3B0y v s oXlUiQfNcK8H5D2A x u rZnWkShPeMaJ7G4C1z w t pYmVjRgOcL9I6E3B0y v r oXlTiQfNbK8G5D2A x u qZnVkShPdMaJ7F4C0z w s pYmUjRgOcL9H6E3B y v r oWlTiQeNbK8G5D1A x t qZnVkSgPdMaI7F4C0z v s pXmUjRfOcK9H6E2B y u rZoWlThQeNbJ8G5D1A w t qYnVkSgPdLaI7F3C0z v s pXmUiRfOcK9H5E2B x u rZoWkThQeMbJ8G4D1z w t qYnVjSgOdLaI6F3C0y v s lThQeNbJ8G5D1A w t qYnVkSgPdLaI7F3C0z v s pXmUiRfOcK9H5E2B x u rZoWkThQeMbJ8G4D1z w t qYnVjSgPdLaI6F3C0y v s pXlUiRfNcK9H5E2A x u rZoWkThPeMbJ7G4D1z w t qYmVjSgOdL9I6F3B0y v s oXlUiQfNcK8H5D2A x u rZnWkThPeMaJ7G4C1z w t pYmVjRgOdL9I6E3B0y v s oXlTiQfNbK8H5D2A x u qZnWkShPdMaJ7F4C1z w s 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上传时间: 2020-05-23

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