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毛细管电泳

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毛细管 电泳
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1 第一节 概述 电电泳 Electrophoresis 是指溶液中带电带电 粒子在电场电场 的作用下向与 自身带带相反电电荷的电电极移动动的现现象 将电电泳发发展成为为分离技术术 应归应归 功于Tiselius 瑞典 蒂塞利乌斯 的工作 他于1937年建立 移 界电电泳 moving boundary electrophoresis 成功地将人血清中 的蛋白质质分为为白蛋白 和 球蛋白 这项这项 工作成为为蛋白质质 化学发发展的基础础 因此Tiselius本人荣获获1948年诺贝诺贝 尔化学奖奖 第15章 毛细管电泳法 电电泳 C 槽和电电极 V1 V2 2 经典电泳法散热差 分离电压受到限制 1981年 Jorgenson和Lukacs发发表了在毛细细管电电泳发发展史 上具有划时时代意义义的工作 他们们采用75 m内径的石英毛细细 管做为为分离室 紫外柱上检测检测 的方法 在30kv的分离电压电压 下分离丹酰酰化氨基酸 柱效达到40万个理论论塔板 他们们的 工作为为毛细细管电电泳的发发展奠定了基础础 James W Jorgenson North Illinois University 化学系教授 3 第二节 基本原理 电泳 electrophoresis 是指溶液中带电粒子 离子 在电场中定 向移动的现象 电泳淌度 单位电场强度下 带点粒子的电泳速率 式中 电泳迁移率 电泳淌度 为电泳速率 一 电电泳和电泳淌度 电泳淌度与带电粒子半径 r 及电荷 q 间的关系 电泳淌度的差异构成了电泳分离的基础 4 二 电渗和电渗淌度 电渗 electroosmosis 是毛细管电泳分离理论中 最基本的概念之一 5 电渗是指在电场作用下 毛细管中或固相多孔物质内 电解 质溶液朝一个方向迁移的现象 电渗速率 与固液两相界面 的双电层Zeta电位 缓冲溶液的介电常数 和黏度 有关 与电场强度成正比 单位场强下的电渗速率 称为电渗淌度 6 三 表观淌度和迁移时间 表观淌度表观迁移速度 正离子 ep eouep ueo 中性分子 eoueo 负离子 eo epueo uep 由于电电渗流速度大大高于电电泳速度 所以 不管正离子 负负离子还还 是中性分子 均随电电渗流移动动 7 1 CE中电渗流的流形 电荷均匀分布 整体移动 电渗流的流动为平流 塞式流 动 谱带展宽很小 高效液相色谱中的溶液流动为层流 抛物线流型 管壁处 流速为零 管中心处的速度为平均速度的2倍 引起谱带展 宽较大 四 柱效和分离度 8 2 CE中电渗流的作用 电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5 7倍 各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为 阳离子运动方向与电渗流一致 阴离子运动方向与电渗流相反 中性粒子运动方向与电渗流一致 1 可一次完成阳离子 阴离子 中性粒子的分离 2 改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性 如 同改变LC中的流速 3 电渗流的微小变化影响结果的重现性 在CE中 控制电渗流非常重要 9 3 无涡流扩散项与传质阻力项 在HPCE中 仅存在纵向扩散 H B u 扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高 分离生 物大分子的依据 影响分离度的主要因素 工作电压V 毛细管有效长度 与总长度比 有效淌度差 分离度可按谱图直接由下式计算 为两组分电泳淌度的差值 10 第三节 毛细管电泳仪和实验操作 一 毛细管电泳仪 11 1 高压电极槽和进样机构 2 填灌清洗机构 3 毛细管 4 检测器 5 铂丝电极 6 低压电极槽 7 恒温系统 8 数据记录处理系统 自动型毛细管电泳仪结构示意图 12 CE的要求 进样机构不存在死体积 能进行精确的进样控制 需有毛细管清洗机构 高压电源至少应能输出200 A 25kV的功率 检测器尽量安装在接地端 优先考虑柱上紫外检测方式 温控范围宽 以0 为界 越宽越好 上限不应低于50 最好能达到65 70 至少能在20 40 内恒温 恒温精度应小于 0 1 13 高压电源一般采用 0 30 kV连续可调的直流高压电源 一般要求电压稳定在 0 1 电极通常由直径0 5mm 1mm的铂丝制成 电极槽通常是带螺帽的玻璃瓶或塑料 瓶 1ml 5ml不等 以便于密封 仪器必须接地 操作过程中必须注意高压的安全保护 一 高压电压电 源 14 二 毛细管 1 尺寸 毛细细管尺寸的选择选择 与分离模式和样样品有关 自由溶液电电泳 多选选用50或75 m内径的毛细细管 分离的有效长长度常控制在 40 100cm之间间 如进进行大颗颗粒如红细红细 胞的分离 则则需要内 径大于 300 m的毛细细管 CGE或CEC的有效长长度一般控制 在20cm左右 2 涂层层 外壁涂一层层聚酰亚酰亚 胺保护层护层 一般内壁不需涂层处层处 理 大分子化合物分离时时 常常需要惰性管壁 以抑制吸附 做 CIEF或CGE时时 需要涂层层毛细细管以抑制电电渗 在分离中 有时为时为 了加强电电渗或改变变其方向 也需要涂层层毛细细管 15 3 清洗 毛细管在使用过程可能被污染 从而影响分析的结果 为使测定具 有良好的重现性 毛细管在使用时应经常清洗 空管通常用 0 l 1mol L NaOH 水和缓冲液顺序冲洗 各洗 5 10min 或增加有机溶剂如甲醇清洗步骤 以除去管中的脂溶性 吸附组分 如果怀疑管内壁吸附有蛋白质或其他有机分子 可用0 l 1mol L的HNO3洗 5 10min 然后再按常规清洗 两次分析之间 可用运行缓冲液清洗 平衡 16 三 进样系统 毛细管通道十分细小 所需样品不过数nl 所以不能采用 色谱的进样方式 通过让毛细管与样品溶液直接接触 然 后由重力 电场力或其它动力来驱动样品进入管中 进样 量可以通过控制驱动力的大小或时间长短来控制 进样系 统必须包括动力控制 计时控制 电极槽或毛细管移位控 制等机构 进样方式 1 压力法 流体力学进样 2 电动法 17 1 压力进样 也称流动进样 它要求毛细管中的填充介 质具有流动性 当毛细管两端置于不同的 压力环境中时 管中溶液即能流动 将样 品带入 可用三种方法产生进样动力 正压 负压 管尾抽吸 重力 虹吸 采用压缩空气 气体钢瓶 可实现正压 进样 并可与毛细管清洗系统共用 多 为商品仪器采用 优点 压力进样没有偏向问题 缺点 选择性差 样品及其背景同时被引入 管中 对后续分离可能产生影响 18 电动进样 当把毛细管的进样端插入样品溶液并加上电场时 组分 就会因电迁移和电渗作用而进入管内 电动进样的控制参数是电场强度E和进样时间t 电场强 度E取值多在1 60kv 60cm 之间 进样时间通常在1 10s 之间 有时可达1min或更大 优点 电动进样对毛细管内的填充介质没有特殊限制 属普适性方法 可实现自动化操作 缺点 电动进样对离子组分存在偏向 降低分析的准确 性和可靠性 19 四 检测器 在毛细管电泳中 毛细管柱内径小 通常50 m或75 m 区带体积小 仅为nl级 区带迁移速度快 这就对检测器 提出了很高的要求 毛细管电泳要求检测方法必须具有很高的灵敏度和很快的 响应速度 且不能引起区带扩张 常用柱上检测法 20 紫外检测 由于紫外检测器价格便宜 通用性好 石英毛细管柱 有良好的紫外透过性 易于实现柱上检测 再加上大 多数有机化合物包括蛋白质等生物大分子都含有紫外 发色团 所以它是目前应用最广的检测器 但是 由 于受毛细管内径的限制 检测灵敏度较低 固定波长检测器 可变波长检测器 二极管阵列检测器 21 激光诱导荧光 LIF 采用激光 强度高 准直性好 可聚焦成比毛细管更 细的光束射入毛细管内部 激发出强的荧光 LIF能减小因毛细管壁的散射所引起的背景噪声 1 激光器 2 高压电源 3 毛细管 4 单色器 5 光电倍增管 6 记录仪 8 激发光光纤 9 荧光收集光纤 22 其他检测器其他检测器 电化学检测器 化学发光检测器 质谱检测器 23 第四节 定性和定量分析方法 一 定性分析方法 以相对迁移时间与对照品对比定性 与质谱联用定性 二 定量分析方法 1 内标法 2 叠加对比法 24 第五节节 毛细细管电电泳的主要分离模式 毛细细管区带电带电 泳 capillary zone electrophoresis CZE 胶束电动电动 色谱谱 micellar electrokinetic chromatography MEKC 毛细细管凝胶电电泳 capillary gel electrophoresis CGE 毛细细管等速电电泳 capillary isotachophoresis CITP 毛细细管等电电聚焦 capillary isoelectric focus CIF 毛细细管电电色谱谱 capillary electrochromatography CEC 25 一 毛细细管区带电带电 泳法 CZE 毛细细管电电泳最基本的分离模式 背景电电解质质是缓缓冲液 分离 是基于样样品中各个组组分间质间质 荷比的差异 有时时需在缓缓冲液中 加入一定的添加剂剂 用以提高分离选择选择 性 改变电变电 渗流的大 小 方向或抑制毛细细管壁的吸附等 在CZE中 影响分离的操作条件为为 分离电压电压 背景电电解质质种类类 浓浓度和pH 添加剂剂种类类和浓浓度 26 分离效率与电压间存在极大值 极大电压通常也是最佳 工作电压 在实际分离中 如果所用的毛细管很细或缓冲液的电导 很低 极大电压可能会超出仪器范围 此时没有最佳电 压 可选择仪器允许的最大输出电压 当毛细管较粗或缓冲液电导较高时 极大电压可能很小 若此时分离度很高 也可选择大于极大值的电压进行 分离 1 分离电压电压 27 毛细细管的温度不仅仅影响分离的重视视性 而且影响分离效 率 温度选择应选择应 考虑热虑热 效应应 分析重现现性 分离效率和 分离介质对质对 温度的限制等因素 温度的确定也应应通过实验过实验 多数情况下 在20 30 之 间进间进 行电电泳 能获获得良好的分离效果 可根据初步分离 结结果调调整温度 不少糖类样类样 品需要高于室温的分离环环境 一些样样品如蛋 白等则则可能需要低于室温的分离条件 2 分离温度 28 对背景电解质的要求 在所选择的pH范围内有足够大的缓冲容量 在检测波长处的吸收低 自身的淌度低 即分子大而荷电小 以减少电流的产 生 应使被测组分带合适的电荷量 以实现有效进样和有 合适的电泳淌度 尽可能采用酸性缓冲溶液 在低pH下 吸附和电渗流 值都很小 与毛细管种类匹配 涂层毛细管只能在一定pH范围内 使用 3 背景电电解质质 29 在CZE中 常用于毛细细管电电泳的缓缓冲溶液有硼砂 磷酸 盐盐 柠柠檬酸盐盐 琥珀酸盐盐和醋酸盐盐等 缓缓冲体系的pH值值要求与样样品的性质质有关 通常酸性组组 分的分离选择选择 在碱性条件下进进行 而碱性组组分则选择则选择 酸性介 质质分离 蛋白质质 多肽肽 氨基酸等两性物质质 可选选酸性 pH2 也可选选碱性 pH 9 分离介质质 糖类样类样 品通常在pH9 11 之间间能获获得最佳分离 羧羧酸或其它样样品多在pH5 9之间选择间选择 分离条件 30 二 胶束电动色谱法 MEKC 在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂 如SDS 当表面活 性剂浓度超过其临界胶束浓度时 则形成胶束 胶束具有疏水内 核 外层带负电荷 溶质分子则在极性缓冲液与胶束中心的非极 性相 假固定相 之间有一定的分配 中性分子因其本身疏水性 不同 在两相中分配存在差异 在电渗流作用下 胶束携带溶 质一起前行 疏水性强的溶质 和胶束结合得较牢 流出慢 溶 质分子由于表观淌度及其在两相 中的分配系数的差异是MEKC分离 的基础 31 常用的阴离子表面活性剂有十二烷基硫酸钠 SDS N 月桂酰 N 甲基牛磺酸钠 LMT 牛磺脱氧胆酸钠 STDC 等 阳离子表面活性剂最常用的是季铵盐 如十二烷基三甲基 溴化铵 DTAB 十六烷基三甲基溴化铵 CTAB 等 非离子型表面活性剂有3 3 氯化酰胺基丙基 二甲基胺基 1 丙基磺酸酯 CHAPS 等 另外 还有手性表面活性剂 如胆酸 毛地黄皂苷 十二 烷基 N L 缬氨酸钠等 32 表面活性剂选择时应考虑以下因素 1 经济易得 2 水溶性好 3 紫外吸收背景越低越好 4 不与样品发生破坏性作用 5 所形成的胶束足够稳定 33 三 环糊精修饰毛细管电泳法 将适量环糊精及其衍生物加入缓冲溶液作为添加剂而进行 的毛细管电泳 分离手型异构 体常用的方法 环糊精 吡喃葡萄糖单元构成锥筒形结构 待分离组分的 分子大小 相对极性 与CD环镶嵌关系决定手性分子的 表观淌度 34 四 毛细管电色谱 CEC 以微填充柱作为分离柱 以电渗流 电渗 液压 驱动流 动相完成色谱分离过程 基于组分的分配系数和电泳淌度及的差异实现组 分的分离 35 CEC中 固定相的选择选择 主要依据HPLC的理论论和经验经验 常用C18或C8 根据固定相的特性 正相 反相等 缓缓冲液可以是水溶 液或有机溶液 常用乙腈腈 水或甲醇 水等为为流动动相 五 毛细管凝胶电泳 分离机理基于电泳与凝胶色谱的组合 36 毛细管分离条件选择流程 1 尽可能多地了解样品的类型 来源 组成及其性质 2 根据样品性质 来源选择分离模式 若无样品信息可先选 CZE 3 根据样品性质确定检测方法 4 确定pH 缓冲试剂浓度 5 优化其它操作参数 如毛细管尺寸 分离电压 温度等 6 确定是否需要使用添加剂和非水溶剂 7 根据分离结果考虑是否换其它分离模式
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