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chapter2+植物细胞工程基本技术

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chapter2 植物 细胞 工程 基本 技术
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第二章 植物细胞工程学基本技术 一 实验室设置及仪器设备 二 实验基本操作 三 培养基的成分及其配制 四 培养条件的选择 一 实验室设置及仪器设备 实验室是细胞工程研究的主要场所, 应能满足清洗、培养基制备、储藏、无菌 操作、培养、鉴定等多方面的工作。 1基本实验室 1.1 洗涤间 根据工作量的大小决定其大小,一般面积控制 在30-50m2。在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽 ,用来清洗玻璃器皿。中央实验台还应配置2个水 槽,用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大,可 以购置一台洗瓶机。准备1-2个洗液缸,专门用于 洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿。此外还应配 置落水架、干燥箱、柜子、超声波清洗器等。地 面应耐湿并排水良好。 60平方米左右,配备的主要仪器设备有 :冰 箱、天平、微波炉、pH计、培养基分装器、药品 柜、器械柜、抽气泵、电炉、各种规格的培养瓶 、培养皿、移液管、烧杯、量筒、容量瓶、储藏 瓶等。冰箱以体积180-200L为宜,用于储存培养 基母液、激素维生素等贵重药品、彩色胶卷、及 保存植物材料。天平应有不同感量。 1.2 培养基配制间 配备实验台、高压灭菌锅、排风灭火设备 、细菌过滤设备、干热消毒柜、电炉等。灭菌 锅的选择应根据不同的要求选择不同型号的灭 菌锅。一般实验室可选用小型的医用手提式高 压灭菌锅,较大的实验室可选用立式自动控制 压力和温度的灭菌锅。生产性的实验室可选用 大型的卧式灭菌锅。 如果没有条件的话,可以将上述工作间合 并成一个准备间,要求是设备的安装和排列要 合理、房间要宽敞、明亮、透风,地面要便于 清洁、防滑。 1.3 消毒间 无菌操作室主要用于实验材料的接种操作, 所以又叫接种室。通常由里外两间组成,外间是 缓冲间,用于准备工作,还有防止污染的作用。 缓冲间的门应该与接种室的门错开,两个门也不 要同时开启,以保证无菌室不因开门和人的进出 带进杂菌。缓冲间内应该设有水槽、实验台、鞋 帽架、和柜子、紫外灯。无菌操作室的内壁应当 用塑钢板或瓷砖装修,工作人员进入操作间前要 穿上消过毒的工作服和拖鞋。 室内应配有超净工作台,紫外灯、解剖镜、 各种接种器械等。 1.4 无菌操作室 为了控制培养室的温度和光照时间及其强度, 培养室的房间不要窗户,但应当留一个通气窗,并 安上排气扇。室内温度由空调控制,光照由日光灯 控制。天花板和内墙最好用塑料钢板装修,地面用 水磨石或瓷砖铺设,一般要分两间,一为光照培养 室,一为暗培养室。培养室外应有一预备间或走廊 。 培养室应配有培养架、转床、摇床、光照培养 箱、生化培养箱、自动控时器等。日光灯一般用 40W,固定在培养架的侧面或搁板的下面,每层有 两支日光灯,距离在20cm,光照强度为2000-3000lx 。 1.5 培养室 2辅助实验室 2.1鉴定室 细胞学鉴定室 其功能是对培养材料进行细胞 学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥,使各 种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。应配置各种 显微镜、照相系统等。 生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的 实验室中,应建立相应的分析化验实验室,以 便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。 离心机、酶联免疫检测仪、天平、PCR仪等。 2.2、温室 为试管苗提供满足生长的适宜环境条件。 1.洗涤 技术 二 实验基本操作 无菌的范畴: 高压高温处理(工具、器皿、培养基 等) 物理或化学处理;火烤后的物体; 健康的动植物不与内外部表面接触的 组织内部可能是无菌的(有时也有内生菌, 但会影响培养,也不会污染) 二.灭 菌 1、物理方法:干热、湿热、过滤(0.25微 米)、紫外灯、超声波等。 2、化学方法:使用灭菌剂或抗菌素,如酒 精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾 、双氧水、福尔马林等 灭菌的方法: 适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌 操作方法:150 、40min或120、120min 如果发现芽孢杆菌,160 、90-120min (1)干热灭菌 适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉 塞、纸等。 121 维持20-30min 注意点:加足水、排尽气、气压降到0时,才能 开盖 (2)湿热灭菌 培养基的灭菌一般用高压高温处理,但如果培 养基中某些成分遇到高温分解(如某些生长调节剂 GA3、玉米素等),就需要过滤灭菌。另外酶、血 清等也需要过滤灭菌 灭菌方法:将生长调节剂或酶配成一定浓度, 用注射器注入微孔滤膜虑,滤膜孔径0.22-0.45微 米。制培养基时,现将培养基高压灭菌,待降至 50左右时,加入适量的激素,然后分装 (3)过滤灭菌 主要是利用紫外灯进行照射,适 合实验室空气、操作台等,灭菌时间 20-30min。 注意:关灯后5min后再进入。超净工 作台关灯后要打开风机。 (4)射线灭菌 用火焰灼烧达到灭菌目的,适用 于接种器皿的灭菌。 (5)火焰灼烧灭菌 适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。 消 毒 剂使用浓度 (%) 消毒时间 (min.) 效 果 残液去除 难易 乙醇70-750.1-3好易 新洁尔灭1020530好易 氯化汞0.11215最好最难 过氧化氢1012515较好最易 抗菌素450mgl-13060较好较难 次氯酸钙/纳9 10530好易 (6)消毒剂 几种常用消毒剂的效果比较 长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方 法:甲醛、高锰酸钾熏蒸。甲醛的用量通常按每 立方米空间2-6毫升计算,高锰酸钾的用量是甲醛 的一半。室内准备妥当后,把称好的高锰酸钾放 在瓷碗或烧杯内(最好在碗或杯下面铺一张报纸, 以利清洗),然后将甲醛也倒入碗或杯内,立即出 屋关门。几秒钟后,甲醛溶液即沸腾挥发。高锰 酸钾是一种氧化剂,当它与一部分甲醛作用时, 由氧化反应产生的热可使其余的甲醛挥发为气体 。 (6)熏蒸灭菌 人为因素(工作人员本身):工作服、帽、口罩、酒精擦手。 物品因素 器 皿 和 用 具 培养皿:洗热压 玻璃器皿:洗干热(干热箱)或晾干 接种用具:用CCL4布擦湿布擦 泡75%95%酒精烧 培养基:湿热 培 养 材 料 外部细菌:用水冲洗化学药剂处理 内部细菌 茎尖培养 加抗生素:青霉素、利福平 操作的空气:洗刷地板95%酒精擦超净工作台 用化学试剂薰蒸 污染来源 三、无菌操作技术 1、实验器具和材料的准备 2、用75%的酒精擦拭超净工作台,然后室内及超 净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。注意:台面 上的用品不要放置太多或重叠放置,以免降低灭 菌效果。 3、关紫外灯、打开风机,过5-10min进入缓冲间 ,以75%洗手和手臂,更换无菌服、帽子和口罩。 进入接种室。(注:没有特别情况,尽量不要下 工作台) 4、用7075的酒精拭擦台面并消毒双手。试 验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯,将金 属器械在其火焰上灼烧,冷却待用。 注意:所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行 。金属器械不能过度灼烧,以防退火。移液管 不能灼烧,培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过 火焰不能时间太长。 5、取流水冲洗(至少30min)过的外植体,用一定 的消毒剂浸泡消毒,用无菌水冲洗34次,放入无 菌培养皿中,置于酒精灯火焰下方,用无菌的接种 器械进行分离、切割或其他处理。 6、打开培养瓶,瓶口在灯焰处旋转灼烧,用镊子将 培养材料置于培养基上,灼烧镊子放回,灼烧瓶口 ,盖上瓶塞。 7、用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。 注意(1)进行培养时,动作要准确敏捷,但又不必 太快,以防空气流动,增加污染机会。(2)不能用 手触及已消毒器皿,如已接触,要用火焰烧灼消毒或 取备品更换。 (3)为拿取方便,工作台面上的用品 要有合理的布局,原则上应是右手使用的东西放置在 右侧,左手用品在左侧,酒精灯置于中央。(4)工 作由始至终要保持一定顺序性,组织或细胞在未做处 理之前,勿过早暴露在空气中。同样,培养液在未用 前,不要过早开瓶;用过之后如不再重复使用,应立 即封闭瓶口直立可增加落菌机会。 (5)吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时,均 应分别使用吸管,不能混用,以防扩大污染或导致细 胞交叉污染。 (6)工作中不能面向操作区讲话或咳嗽,以免唾沫 把细菌或支原体带入工作台面发生污染。 (7)手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方 ,瓶口最易污染,加液时如吸管尖碰到瓶口,则应将 吸管丢掉。 接种时时在近火焰处处打开瓶口,使瓶倾倾斜, 以免空气中微生物落入瓶中 正 确 错错 误误 整个接种操作应在近火焰处进行,且动作要 迅速 正 确 错错 误误 接种过程中尽可能达到悬空要求 防止操作带带来的污污染 正 确 错错 误误 接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口 正 确 错错 误误 瓶盖朝上放,接种完毕后立即盖好瓶 口 正 确 错错 误误 接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生 种子和分生组织:培养时通常将其贴放在培养基表 面,而不是插到培养基内部,以免供氧不足 正 确 错错 误误 接种茎段:注意形态学下端插入培养基内 ,而形态学上端露于空气中 正 确 错错 误误 四、外植体的选择与处理技术 用于外植体分离的母体植物材料一般有3种来 源:一是生长在自然环境下的植物;二是在温室控 制环境条件下生长的植物;三是无菌环境下已经过 离体培养的植物。 (一)、外植体的选择 1、选择优良的基因型 试验首先要明确目的。例如,蔬菜、作物等的脱 毒快繁,是为了脱去病毒,提高产量和质量,就应选 择当地栽培确认的高产优质的品种作为脱毒的材料, 并且品种一定要可靠。花卉、观赏植物的快繁,也应 选择有价值的植物。 2、取材 从生长旺盛、健壮、无病虫害的植株上取材。 母柱代谢旺盛期切取的外植体再生能力强,试验容易 成功。 3、外植体大小选择 因外植体不同而不同。如利用茎尖培养,, 茎尖大小对脱毒效果非常明显。再如幼胚培养,胚 龄也非常重要。(以后具体讲) 4、选择外植体的时期 外植体的生长动态往往与该物种的生长规律 (生物钟)有关。因此,最好在植物生长的最适宜 时期取材培养。会得到较好的结果。 (二)、外植体的处理 1、取材母株的预处理 人工管理,促进母株生长旺盛、代谢活跃, 从其上取材培养,容易成功。 2、外植体休眠的处理 有些植物的种子、幼胚、或芽,存在休眠 。为了打破休眠,可利用低温处理,或赤霉素 等化学物质处理。因植物不同处理温度和时间 有所不同。 3、 组织内生菌的处理 (1)加入抗生素,注意抗生素的用量,高浓 度容易造成培养物的死亡 (2)取生长期旺盛的生长点部位作为起始培 养的外植体。 (3)取被内生菌污染的培养物的 茎尖不停 的转接。 三 .培养基的配制 培养基的种类 高无机盐含量培养基 高硝态氮培养基 中等无机盐含量培养基 低无机盐含量培养基 1、高无机盐含量培养基 钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高,微量元 素种类齐全,比例适当,离子平衡性好 ,具有较强的缓冲性,养分数量及比例 比较合适,广泛用于植物的器官、花药 、细胞及原生质体的培养。主要有MS、 LS、BL、BM、ER培养基。 硝酸钾含量高,氨态氮的含量低,含有较高的 VB1。主要适合与木本植物、十字花科植物和单子 叶植物的组织和花药培养。主要有B5、N6、SH培养 基。 2、高硝态氮培养基 大量元素约为MS培养基的一半,微量元素 种类减少,但含量较MS的高,维生素种类比MS 多,如增加了生物素、叶酸等。适合于花药培 养,主要有Nitch,NT、H、Miller培养基。 3、中等无机盐含量培养基 大量元素含量大幅度降低而且种类减少,有机 含量相对也很低。多数用于生根培养基,主要有 White、Heller、WS、HE、HB。 4、低无机盐含量培养基 培 养 基 的 种 类 诱导培养基 增殖培养基 生根培养基 完全培养基 基本培养基 1.无机营养成分:一般在现有培养基配方中选择 。可以参考前人的经验,例如:MS是广谱性培养 基,N6用于单子叶植物的培养。豆科多用B5培养 基。 2、植物生长调节剂:必须进行筛选试验。总体原 则-当诱导愈伤组织形成时,细胞分裂素和生长素 相对平衡;诱导芽分化时,细胞分裂素水平应高 于生长素,诱导根则要低。 3、有机成分:要根据培养类型考虑,如进行器官 和组织培养,一般不加复杂有机成分,而进行细 胞和原生质体培养则要加。 培养基的筛选 (一)、贮备液(母液)的配制 为什么要配制母液? 培养基的配制 (二)、培养基配制 计量 移液 称取琼脂蔗糖 融化 混合 调pH 分装 包扎 (三)培养基的灭菌 培养中温度、光照、湿度等各种环境 条件,培养基组成、pH值、渗透压等各种 化学环境条件。 四 培养条件的选择 一. 光照的影响 培养中光照也是重要的条件之一, 主要表现在光强、光质以及光周期: 光周期:黑暗与光照交替的时间 光 量:光照强度 光 质:光的波长 例1:黑暗中培养的烟草花药,其胚状体的分 化与幼植物的生长,同经光照培养一样的多 例2:短日照敏感的葡萄品种,它的茎切段, 仅在短日照条件下才能分化成根 例3:对日照不敏感的葡萄品种,可在任何光 周期下分化成根 结论:光周期的需要与否,应根据植物种类 、培养的目的来决定 1、光周期 最常用的周期是16h的光照,8h的黑暗; 愈伤组织诱导阶段,一般采用三种做法:全暗、 周期性光照、散射性光照。依据植物种类不同做 法不同,多数植物适合全暗或周期性光照; 器官发生阶段:一般给予周期性光照比较好。 离体培养中光周期的调节 一般来说,光照强度较强,幼苗生长的粗壮 ,而光照强度较弱幼苗容易徒长。 离体培养条件下常用的光量,一般为1000- 4000lx(勒克斯)。离体培养中通常难以达到 4000lx,一般光量在2000-3000lx。光照强度的高 低直接影响器官分化的频率。 高光量可以降低植物体内生长素水平,低光 量使植物体内生长素素水平较高,容易生根 2、光量的影响 光质对愈伤组织诱导,培养组织的增殖以及器官的分化 都有明显的影响。 如百合珠芽在红光下培养,2周后,分化出愈伤组织。但 在蓝光下培养,几周后才出现愈伤组织,而唐菖蒲子球块接 种15天后,在蓝光下培养首先出现芽,形成的幼苗生长旺盛 ,而白光下幼苗纤细。 离体培养条件下,一般用日光灯进行光照,光谱成分主 要是蓝紫光,波长为419-467nm。对芽分化有效光谱成分为 蓝紫光,根分化则受600-680nm所刺激。 3、光质的影响 二. 温度的影响 培养都是在2327之间,一般252。 喜温性植物:茄科、禾本科、兰科等。培 养温度一般控制在26-28 冷凉性植物:百合科、十字花科、菊科等 。通常培养温度控制在18-22 或<25 三. 湿度的影响 组织培养中湿度的影响有两个方面: 一是培养容器内的湿度条件,容器内主要受 培养基水分含量和封口材料的影响。 一是环境的湿度条件。环境的相对湿度一般要 求7080%。常用加湿器或经常洒水的方法来 调节湿度。 四. pH值 不同的植物对培养基最适PH值的要求也是 不同的(见表),大多在5.5-6.5左右,一般 培养基皆要求5.8,这基本能适应大多数植物 培养的需要。 种类最适PH值种类最适PH值 杜鹃4.0月季5.8 越橘4.5 胡萝卜、石刁柏 6.0 蚕豆5.5桃7.0 番茄、葡萄5.7 种类种类 五.渗透压 培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化 合物,因此,而影响到渗透压的变化。通常1 -2个大气压对植物生长有促进作用,2个大气 压以上就对植物生长有阻碍作用,而5-6个大 气压植物生长就会完全停止,6个大气压植物 细胞就不能生存。 培养基各种物质中,糖对培养基渗透压起 决定性作用。因此调节渗透压往往从调节糖浓度 着手。糖除了作为渗透压调节物质外,还是培养 基重要的碳源和能源。另外,甘露醇,山梨醇等 也可以作为调节物质。 渗透压调节物质 氧气是培养中必需的因素,瓶盖封闭时要考 虑通气问题,可用附有滤气膜的封口材料。通气 最好的是棉塞封闭瓶口,但棉塞易使培养基干燥 ,夏季易引起污染。固体培养基可加进活性炭来 增加通气度,以利于发根。培养室要经常换气, 改善室内的通气状况。液体振荡培养时,要考虑 振荡的次数、振幅等,同时要考虑容器的类型、 培养基等。 六.气体影响
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