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小叶榕叶水提物浸膏的HPLC指纹图谱初步研究

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小叶 榕叶水提物 浸膏 HPLC 指纹 图谱 初步 研究
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1小叶榕叶水提物浸膏的 HPLC 指纹图谱初步 研究作者:赖毅勤,刘峰,周宏兵,陈加林【摘要】 目的 研究小叶榕叶水提物浸膏的 HPLC 指纹图谱。 方法 色谱柱为大连依立特 ODS C18(250 mm×4.6 mm,5 μm) ;以 90%甲醇-水-0.2%H3PO4 为流动相 A,以 20%四氢呋喃-水-0.2%H3PO4 为流动相 B,按一定比例配制,梯度洗脱;柱温为 31 ℃;流速为 1 mL/min;检测波长为 275.5 nm;分析时间为 120 min。结果 初步建立了小叶榕叶水提物浸膏的 HPLC 指纹图谱,标定了 19 个共有指纹峰,并对 7 个共有指纹峰进行了标记。结论 该法建立的指纹图谱具有可靠性,可为进一步研究小叶榕叶水提物的质量标准提供依据。 【关键词】 小叶榕叶;指纹图谱;高效液相色谱法Abstract:Objective To determine the HPLC fingerprints of the aqueous extracts of Folium fici microcarpae.Methods The extracts was analyzed on an ODS C18 column (4.6 mm×250 mm,5 μm) using 90% methanol-water-0.2%H3PO4 as gradient elute A,20% tetrahydrofuran-water-0.2%H3PO4 as gradient elute B.The flow rate was 1 mL/min and column temperature 31 ℃. The detection wavelength was 275.5 2nm. Results HPLC fingerprints of the aqueous extracts of Folium fici microcarpae was established. A total of 19 common peaks have been identified and 7 compounds which were separated from leaves could be found the relative peaks in chart.Conclusion The fingerprints are reliable,which could be used for quality control of the aqueous extracts of Folium fici microcarpaeKey words:Folium fici microcarpae ; fingerprints;HPLC小叶榕叶是桑科植物榕属小叶榕 Ficus microcarpa L.f.的干燥叶子,主要产于广东和广西[1] 。小叶榕叶水提物浸膏作为咳特灵的主成分收载在部颁标准[2]中,用于治疗哮喘和慢性支气管炎。目前的部颁标准,只对小叶榕叶水提物浸膏做了薄层鉴别,质量标准较简单。本文对小叶榕叶水提物浸膏进行了 HPLC 指纹图谱的研究,为进一步研究和制订小叶榕叶及其提取物 HPLC 指纹图谱奠定实验依据。1 仪器与试药1.1 仪器3福立 2000 高效液相色谱仪:N2000 色谱工作站,二元泵,柱温箱,紫外检测器。1.2 试剂试剂均为色谱纯,并用 0.45 μm 微孔滤膜过滤。1.3 对照品苯甲酸、1-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-乙酮、2-羟基苯甲酸、4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、红花菜豆酸、4-甲氧基-3,5-二羟基苯甲酸,均为作者从小叶榕叶水提物中分离得到的化合物,并经 IR、EI-MS、NMR 鉴定结构,纯度经 HPLC 检测大于98.5%。1.4 药材小叶榕叶水提物浸膏,白云山制药厂提供。2 方法与结果42.1 供试品溶液的制备取小叶榕叶水提物浸膏约 1 g,蒸馏水溶解后,乙醇醇沉使溶液醇浓度为 50%[3] ,滤除不溶物,挥除乙醇直至没有醇味,得滤液。滤液用石油醚萃取 3 次,再用乙酸乙酯萃取 3 次[2] ,得乙酸乙酯层浸膏。将乙酸乙酯层浸膏用适量的甲醇溶解,定容至 10 mL,用0.45 μm 微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。2.2 对照品溶液的制备取各对照品适量,甲醇溶解后,定容至 1 mL,用 0.45 μm的微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。2.3 检测波长的选择取按“2.1”项方法制备的供试液进行紫外扫描,所得图谱见图 1。从图 1 可见,275.5 nm 处有最大吸收峰,故确定 275.5 nm为检测波长。图 1 小叶榕叶供试液的紫外扫描图(略)Fig.1 UV chromatogram of the aqueous extract of 5Folium fici microcarpae2.4 色谱条件色谱柱为大连依立特 ODS C18(250 mm×4.6 mm,5 μm) ; 流动相:以 90%甲醇-水-0.2%H3PO4 为流动相 A,以 20%四氢呋喃-水-0.2%H3PO4 为流动相 B,按表 1 比例配制进行梯度洗脱;柱温为 31 ℃;流速为 1 mL/min;检测波长为 275.5 nm;分析时间为 120 min;进样量为 20 μL。表 1 梯度洗脱表(略)Tab.1 Gradient elution time2.5 方法学考察 2.5.1 空白试验 吸取溶剂 20 μL,按“2.4”项条件进样测定,记录色图谱,结果见图 2。从图 2 可见,溶剂对测定无干扰。图 2 空白试验(略)Fig 2 HPLC chromatogram of the blank assay62.5.2 精密度试验 取同一份供试品溶液,连续进样 5 次,比较共有峰的相对保留时间及峰面积比值。结果各共有峰的相对保留时间在均值±1 min 内,RSD 在 0.2%~0.8%之间,各共有峰的峰面积比值的 RSD 在 0.7%~2.7%之间,表明共有峰的相对保留时间和峰面积比值的 RSD 均符合指纹图谱检测要求[4] 。 2.5.3 稳定性试验 取同一份供试液,分别在 0、2、4、6、24 h 进样测定,比较共有峰的相对保留时间及峰面积比值。结果各共有峰的相对保留时间在均值±1 min 内,RSD 在 0.3%~0.8%之间,各共有峰的峰面积比值的 RSD在 0.8%~2.9%之间。表明供试液在 24 h 内稳定,符合指纹图谱检测要求[4] 。2.5.4 重现性试验 取同一批小叶榕叶水提物浸膏,按“2.1”下制备 5 份供试液,分别进样测定,比较共有峰的相对保留时间及峰面积比值。结果各共有峰的相对保留时间在均值±1min 内,RSD 在 0.3%~0.8%之间,各共有峰的峰面积比值的 RSD 在 1.2%~2.8%之间,表明共有峰的相对保留时间和峰面积比值的 RSD 符合指纹图谱检测要求[4,5] 。2.6 指纹图谱及技术参数2.6.1 共有指纹峰的标定 取 3 批小叶榕叶水提物浸膏,对7其 HPLC 指纹图谱做初步考察,初步确定了 19 个分离度较好且峰面积稳定的峰为共有峰。结果见图 3。图 3 小叶榕叶提取物浸膏的指纹图谱(略)Fig.3 HPLC fingerprints of the aqueous extracts of Folium fici microcarpae2.6.2 共有指纹峰的相对保留时间 根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》 ,确定平均保留时间为 44.643 min 的 8号共有峰为内标参照峰,其余 18 个共有指纹峰与参照峰相比,相对保留时间依次为:0.1283、0.1459、0.1610、0.2628、0.3947、0.4878、0.7581、1.1026、1.3346、1.6920、1.7398、1.8135、1.8807、1.8946、2.0636、2.0788、2.1154、2.1421。2.6.3 共有指纹峰的相对峰面积 根据初步研究,共有峰面积占总峰面积比值为 66.310%~80.094%。保留时间小于 30 min 的共有峰:单峰面积占总峰面积大于 10%而小于 20%的共有峰为 5 号,其相对峰面积比值为 0.9102~0.9717,差值小于±25%。保留时间超过 30 min 的共有峰:单峰面积占总峰面积大于 10%而小于 20%的共有峰为 7 号和 8 号,7 号峰的相对峰面积比值为 0.5915~0.6725,8其差值小于±25%。结果符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》 。2.7 部分共有峰的标记取各对照品溶液 20μL,分别注入高效液相色谱仪,HPLC 色谱图见图 3。结果确认了以下 7 个共有峰:11 号峰为苯甲酸(75.332 min) ,12 号峰为 1-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-乙酮(77.298 min) ,7 号峰为 3-羟基-4-甲氧基苯甲酸(32.865 min) ,内标参照峰为 4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酸(43.832 min) ,6 号峰为 4-羟基苯甲酸(21.232 min) ,16 号峰为红花菜豆酸(91.398 min) ,5 号峰为 4-甲氧基-3,5-二羟基苯甲酸(17.165 min) 。3 讨论3.1 目前国内文献中,一般都以总黄酮作为咳特灵中小叶榕叶水提物的质量指标,用 Al(NO3)3-NaNO2-NaOH 比色法[3] ,或以槲皮素为对照品,用紫外分光光度法在 265 nm 处[5]测定其总黄酮含量。但作者从小叶榕叶分离得到的 7 个化合物,通过 HPLC 检测均为含量较大的共有峰,均不是黄酮类化合物。另外,文献[6~8]报道,在小叶榕叶中甲醇提取物中分离出的 42 个化合物中也仅有 3 个黄酮类化合物。Al(NO3)3-NaNO2-NaOH 的黄酮专属性不强,一些具有邻二9酚羟基的非黄酮物质也会发生反应[8] 。分别称量对照品 1 至 7,每个化合物约 0.0003 g。将这 7 个化合物混合后,用甲醇溶解,定容至 10 mL。取少量混合液作为空白对照进行紫外扫描,结果见图 4。吸取 6 mL 混合液置 25 mL 的容量瓶中,加 1 mL 质量分数为 5%的NaNO2,摇匀,放置 6 min,再加 1 mL 质量分数 10%的 Al(NO3)3,摇匀,放置 6 min,最后加 1 mL 质量分数 4%的 NaOH,加水至刻度,摇匀。加入 NaOH 后观察到溶液从透明无色变为黄色。在 15 min 内对反应液进行紫外扫描,结果见图 5。两图比较,反应后的溶液在 500 nm 处有明显吸收,而反应前的空白液在 500 nm 处则无吸收。说明从小叶榕叶中分离得到的化合物,混合后也能发生 Al(NO3)3-NaNO2-NaOH 反应。综上所述,作者认为以总黄酮作为小叶榕叶水提物浸膏的质量指标,用 Al(NO3)3-NaNO2-NaOH 比色法进行测定的方法是否合理,值得进一步探讨,建立其 HPLC 指纹图谱可能更科学。图 4 空白对照紫外扫描图(略)Fig.4 UV chromatogram of blank assay图 5 反应后紫外扫描图(略)Fig.5 UV chromatogram of reaction103.2 由于条件和时间限制,本文只对 3 批小叶榕叶水提物浸膏的 HPLC 指纹图谱做了初步研究,共有峰面积占总峰面积的平均比值为 73.247%,暂未达到《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》中非共有峰总面积不得大于总峰面积 10%的要求。今后将收集不同产地的小叶榕叶作进一步的研究。【参考文献】[1] 江苏新医学院.中药大辞典[M].上海:上海科学技术出版社,2001:2528-2529.[2] 中华人民共和国卫生部.WS3-B-2742-97 咳特灵片[S].[3] 叶荣科,张德志,周宏兵,等.小叶榕树叶总黄酮水提醇沉工艺研究[J].广东药学院学报,2003,19(4):330-331.[4] 蔡宝昌,刘训红.常用中药材 HPLC 指纹图谱测定技术[M].北京:化学工业出版社, 2005:1-18,23.[5] 贾茹冰.咳特灵胶囊中小榕树膏总黄酮的含量测定[J].广西中医学院学报,2000,17(4):65-66.11[6] 林焕祐.正榕叶部之成分研究[D].台湾大学,2003.[7] KUO Yueh-Hsiung,LIN Huan-you.Two novel triterpenes from the leaves of ficus microcarpa[J]. Helvetica Chimica Acta,2004,87(5):1071-1076.[8] 郭亚健,范莉,王晓强,等.关于 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法测定总黄酮方法的探讨[J].药物分析杂志,2002,22(2):97-98.
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